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Journal of Peking University(Health Sciences) >

2025 , Vol. 57 >Issue 5: 926 - 933

DOI: https://doi.org/10.19723/j.issn.1671-167X.2025.05.017

Effect of the combination of alkaloids from Euodiae Fructus and berberine in Zuojin Pill on cytotoxicity in HepG2 cells

  • Yadong GAO 1, 2 ,
  • An ZHU 1, 3 ,
  • Ludi LI 1 ,
  • Yingzi LI 1 ,
  • Qi WANG , 1, 4, 5, *
Expand
  • 1. Department of Toxicology, Peking University School of Public Health, Beijing 100191, China
  • 2. Fujian Provincial Key Laboratory of Zoonosis Research, Fujian Provincial Center for Disease Control and Prevention, Fuzhou 350012, China
  • 3. Key Laboratory of Ministry of Education for Gastrointestinal Cancer, School of Basic Medical Sciences, Fujian Medical University, Fuzhou 350108, China
  • 4. Key Laboratory of State Administration of Traditional Chinese Medicine for Compatibility Toxicology, Beijing 100191, China
  • 5. Beijing Key Laboratory of Toxicological Research and Risk Assessment for Food Safety, Beijing 100191, China
WANG Qi, e-mail,

Received date: 2024-02-07

  Online published: 2025-05-07

Supported by

the National Key Research and Development Program of China(2018YFC1704500)

the National Key Research and Development Program of China(2018YFC1704506)

Copyright

All rights reserved. Unauthorized reproduction is prohibited.
Fold

Abstract

Objective: To investigate the hepatotoxicity of alkaloids from Euodiae Fructus combined with berberine (BBR) in Zuojin Pill, and to preliminarily explore the possible detoxification mechanism of the combination components. Methods: The combination ratio of components was determined by the maximum concentration (Cmax) of the chemical components in Zuojin Pill. HepG2 cell model was used to investigate the combined toxicity of the hepatotoxic components from Euodiae Fructus, such as evodiamine (EVO) or dehydroevodiamine (DHED), with BBR for 48 h. The experimental groups were set as follows: the vehicle control group, the EVO group, the DHED group, the BBR group, and the combination group of EVO or DHED with BBR. The cell counting kit-8 (CCK-8) method was used to determine the cell viability, and the combination index (CI) was used to determine the combined toxicity of the components. The alanine transaminase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), lactate dehydroge-nase (LDH), and alkaline phosphatase (ALP) activities as well as total bilirubin (TBIL) content in the cell culture supernatant were detected. The protein expression levels of bile acid transporters, such as bile salt export pump (BSEP) and multidrug resistance-associated protein 2 (MRP2), were detected by Western blot. The intracellular malondialdehyde (MDA) content and superoxide dismutase (SOD) activity in HepG2 cells were detected. Results: Compared with EVO or DHED group, the combination of EVO 1 μmol/L with BBR 10 μmol/L or DHED 50 μmol/L with BBR 35 μmol/L significantly increased cell viability of HepG2 cells (P < 0.01), with CI values of 77.89 or 4.49, respectively, much greater than 1. Significant decreases in the activities of ALT, AST, LDH, ALP, and TBIL content in the cell culture supernatant were found in both combination groups (P < 0.05, P < 0.01). Compared with the EVO group, the combination of EVO with BBR upregulated the protein expression levels of BSEP and MRP2. Compared with the DHED group, the combination of DHED with BBR significantly downregulated the protein expression levels of BSEP and MRP2 (P < 0.01). Compared with EVO or DHED group, the combination of EVO or DHED with BBR significantly reduced the MDA content in HepG2 cells (P < 0.05, P < 0.01). Conclusion: A certain ratio of BBR combined with EVO or DHED had an antagonistic effect on HepG2 cytotoxicity, which might be related to regulating the expression of bile acid transpor-ters, and reducing lipid peroxidation damage.

Key words： Evodiamine; Dehydroevodiamine; Berberine; Toxicity of Chinese medicine; Chemical and drug induced liver injury

Cite this article

Yadong GAO , An ZHU , Ludi LI , Yingzi LI , Qi WANG . Effect of the combination of alkaloids from Euodiae Fructus and berberine in Zuojin Pill on cytotoxicity in HepG2 cells[J]. Journal of Peking University(Health Sciences), 2025 , 57(5) : 926 -933 . DOI: 10.19723/j.issn.1671-167X.2025.05.017

经典中药方剂左金丸由黄连(Coptidis Rhizoma)和吴茱萸(Euodiae Fructus)按质量比6 ∶ 1的比例组成，临床上被广泛应用于治疗胃炎、胃食管反流、消化道溃疡等消化系统疾病。吴茱萸有小毒[1]，有研究表明肝脏是其主要的毒性靶器官[2-3]，左金丸中吴茱萸通过与黄连配伍可达到增效、减毒的效果。在中药的现代化研究进程中，随着对中药药效物质的基础和作用机制的研究日渐加深，成分配伍成为中药配伍研究的新领域[4]。本课题组的前期研究发现，吴茱萸碱(evodiamine，EVO)和去氢吴茱萸碱(dehydroevodiamine，DHED)对HepG2细胞有细胞毒性，是吴茱萸潜在的肝毒性成分。既往研究表明，黄连的主要活性成分小檗碱可通过调节脂质代谢、调节胆汁酸代谢、抗炎、抗氧化等发挥肝保护作用[5]，推测小檗碱与吴茱萸的肝毒性成分联用可能具有减毒作用。目前，吴茱萸生物碱与小檗碱联合用药的研究主要集中在药效方面，但其联用是否具有减毒作用尚不清楚。本研究拟从成分配伍层次探讨吴茱萸潜在肝毒性成分EVO或DHED与小檗碱联用对HepG2细胞肝毒性的影响，并对联合用药可能的减毒作用机制进行初步探讨，为阐释吴茱萸和黄连配伍的减毒作用机制以及左金丸组方的安全性提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 细胞系

HepG2细胞由北京大学公共卫生学院毒理学系赵鹏老师惠赠，其购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心，实验所用代数为9~25代。

1.2 药物及主要试剂

EVO、DHED和小檗碱由北京大学药学院天然药物学系杨秀伟教授提供，其纯度均≥98%。通过细胞计数试剂盒(cell counting kit-8，CCK-8)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)检测试剂盒检测细胞增殖及毒性，上述试剂均购自上海碧云天生物技术有限公司。谷丙转氨酶(alanine transaminase，ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和总胆红素(total bilirubin，TBIL)检测试剂盒均购自南京建成生物工程有限公司。兔抗人胆汁酸转运体胆盐输出泵(bile salt export pump，BSEP)(ab155421)和多耐药相关蛋白2(multidrug resistance-associated protein 2，MRP2)(ab172630)抗体均购自英国Abcam公司。小鼠抗人β-actin抗体(TA-09)、辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(ZB-2305)和辣根酶标记山羊抗兔IgG(ZB-5301)均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 主要仪器

HERAcell 150i CO2培养箱购自美国Thermo Scientific公司，FLUOstar Omega多功能酶标仪购自德国BMG公司，Mini-PROTEAN Tetra Cell小垂直板电泳转印系统购自美国Bio-Rad公司。

1.4 细胞培养

将HepG2细胞在含有10%(体积分数)胎牛血清、100 U/mL青霉素和0.1 g/L链霉素的DMEM培养基中培养，置于含5%(体积分数)CO2的37 ℃细胞培养箱中，每2~3天传代一次。

1.5 受试物处理

受试物联合比例参照左金丸中各化学成分吸收入血的峰浓度[6](maximum concentration，Cmax)比值，分别为EVO ∶小檗碱=1 ∶ 10，DHED ∶小檗碱= 1.4 ∶ 1。
EVO与小檗碱组的分组为：溶剂对照组(0 μmol/L)、EVO组(EVO 1 μmol/L)、小檗碱组(小檗碱10 μmol/L)、EVO+小檗碱组(EVO 1 μmol/L+小檗碱10 μmol/L)。
DHED与小檗碱组的分组为：溶剂对照组(0 μmol/L)、DHED组(DHED 50 μmol/L)、小檗碱组(小檗碱35 μmol/L)、DHED+小檗碱组(DHED 50 μmol/L+小檗碱35 μmol/L)。
采用同时给药方式，分别处理HepG2细胞48 h。

1.6 细胞存活率检测

采用CCK-8法检测联合用药处理后细胞的存活率，将处于对数生长期、浓度为1×105/mL的HepG2细胞接种于96孔板，每孔100 μL，培养24 h后弃去上清液，各组分别处理HepG2细胞48 h。孵育结束后每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育30 min，使用多功能酶标仪在450 nm处检测各孔的光密度值，并计算细胞存活率和联合指数(combination index，CI)。

1.7 肝功能生化指标检测

将处于对数生长期、浓度为2×105/mL的HepG2细胞接种于24孔板，每孔0.5 mL，联合给药处理HepG2细胞的方法同1.6小节，处理结束后吸取细胞培养液，经600×g离心5 min后取上清液，分别按照各试剂盒说明书操作，测定ALT、AST、LDH、ALP活性和TBIL含量。

1.8 Western blot检测胆汁酸转运体蛋白表达量

将处于对数生长期的HepG2细胞接种于25 cm2培养瓶，联合给药处理HepG2细胞的方法同1.6小节，处理结束后提取细胞总蛋白，采用二喹啉甲酸法(bicinchoninic acid assay，BCA)进行蛋白浓度定量，加入蛋白上样缓冲液后置于沸水浴进行蛋白变性。用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)进行蛋白分离电泳，以聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)印迹膜进行转膜，然后用5%(质量分数)脱脂奶粉溶液封闭2 h。经含0.05%(体积分数)吐温20的Tris缓冲盐溶液(tris-buffered saline with tween-20，TBST)清洗条带后，4 ℃孵育一抗过夜，TBST充分清洗条带后，再次室温孵育二抗1 h，后经TBST清洗条带后，采用极超敏化学发光试剂曝光成像。

1.9 MDA含量和SOD活性检测

将处于对数生长期、浓度为2×105/mL的HepG2细胞接种于6孔板，每孔2 mL，联合给药处理HepG2细胞的方法同1.6小节，处理结束后使用裂解液裂解细胞，经4 ℃离心吸取上清液，并采用BCA法测定其总蛋白浓度，按照试剂盒说明书分别测定MDA含量和SOD活性。

1.10 统计学分析

吴茱萸生物碱和小檗碱之间的联合毒性作用依据CI法[7]进行判断，CI的定义公式为:
$\mathrm{CI}=\frac{(D)_1}{\left(D_x\right)_1}+\frac{(D)_2}{\left(D_x\right)_2}, $
其中，(D)1和(D)2为吴茱萸生物碱和小檗碱联合给药时的剂量，(Dx)1和(Dx)2为吴茱萸生物碱和小檗碱联合给药各自达到细胞抑制率时的给药剂量。采用CompuSyn软件计算CI，CI＜1、CI=1和CI>1时，分别提示为协同、相加和拮抗作用。
采用SPSS 24.0软件对数据进行统计分析，实验数据均以$\bar x \pm s$表示，采用单因素方差分析(one-way analysis of variance，ANOVA)比较多组间差异，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 联合用药对HepG2细胞存活率的影响

如图 1A所示，EVO与小檗碱组中，与溶剂对照组相比，EVO组HepG2细胞存活率降低至70.1%，小檗碱(10 μmol/L)组细胞存活率升高至115.3%，差异有统计学意义(P＜0.01)。与EVO组相比，EVO+小檗碱组细胞存活率升高至93.5%，差异有统计学意义(P＜0.01)。EVO+小檗碱组的CI值为77.89，远大于1，提示二者联合具有拮抗作用，表明该实验条件下，小檗碱与EVO配伍可降低EVO的细胞毒性，具有显著的减毒作用。
图1 EVO、DHED和小檗碱处理48 h对HepG2细胞存活率的影响($\bar x \pm s$, n=3)

Figure 1 Effects of EVO, DHED and BBR treatment for 48 h on the cell viability of HepG2 cells ($\bar x \pm s$, n=3)

A, the cells were treated with EVO 1 μmol/L, BBR 10 μmol/L, or EVO 1 μmol/L+BBR 10 μmol/L; B, the cells were treated with DHED 50 μmol/L, BBR 35 μmol/L, or DHED 50 μmol/L+BBR 35 μmol/L for 48 h, respectively. **P < 0.01, compared with the control group; ##P < 0.01, compared with the EVO or DHED group. EVO, evodiamine; BBR, berberine; DHED, dehydroevodiamine.

如图 1B所示，DHED与小檗碱组中，与溶剂对照组相比，DHED组HepG2细胞存活率降低至77.9%，差异有统计学意义(P＜0.01)，小檗碱(35 μmol/L)组的细胞存活率没有显著变化。与DHED组相比，DHED+小檗碱组细胞存活率升高至92.6%，差异有统计学意义(P＜0.01)。DHED+小檗碱组的CI值为4.49，大于1，提示二者联合具有拮抗作用，表明该实验条件下，小檗碱与DHED配伍可降低DHED的细胞毒性，具有较强的减毒作用。

2.2 联合用药对肝功能生化指标的影响

如图 2A所示，EVO与小檗碱组中，与溶剂对照组相比，EVO组细胞培养上清液中ALT、AST、LDH、ALP活性和TBIL含量均有不同程度升高，且LDH和ALP升高的差异有统计学意义(P＜0.01)。与EVO组相比，EVO+小檗碱组细胞培养上清液中ALT、AST、LDH、ALP活性和TBIL含量均有不同程度降低，且ALT、AST、LDH和ALP降低的差异均有统计学意义(P＜0.05、P＜0.01)。
图2 EVO、DHED和小檗碱处理48 h对HepG2细胞肝功能指标的影响($\bar x \pm s$, n=3)

Figure 2 Effects of EVO, DHED and BBR treatment for 48 h on the liver function indicators of HepG2 cells ($\bar x \pm s$, n=3)

Group A and group B are the same as Figure 1. * P < 0.05, ** P < 0.01, compared with the control group; # P < 0.05, ## P < 0.01, compared with the EVO or DHED group. EVO, evodiamine; BBR, berberine; DHED, dehydroevodiamine; ALT, alanine transaminase; AST, aspartate amino-transferase; LDH, lactate dehydrogenase; ALP, alkaline phosphatase; TBIL, total bilirubin.

如图 2B所示，DHED与小檗碱组中，与溶剂对照组相比，DHED组细胞培养上清液中ALT、AST、LDH和ALP活性均有不同程度升高，差异均有统计学意义(P＜0.05、P＜0.01)；TBIL含量降低，差异无统计学意义。与DHED组相比，DHED+小檗碱组细胞培养上清液中ALT、AST、LDH、ALP活性和TBIL含量均有不同程度降低，差异均有统计学意义(P＜0.01)。

2.3 联合用药对胆汁转运体蛋白表达的影响

BSEP和MRP2是重要的胆汁酸转运体。如图 3A所示，EVO与小檗碱组中，EVO组的BSEP和MRP2蛋白表达量分别下降至溶剂对照组的62.5%和80.6%，差异均有统计学意义(P＜0.05)。与EVO组相比，EVO+小檗碱组的BSEP和MRP2蛋白表达量分别上调至溶剂对照组的82.6%和84.8%，提示该实验条件下，小檗碱配伍减轻EVO所致肝细胞毒性的机制可能与上调BSEP和MRP2蛋白表达水平相关。
图3 EVO、DHED和小檗碱处理48 h对HepG2细胞BSEP和MRP2蛋白表达的影响($\bar x \pm s$, n=3)

Figure 3 Effects of EVO, DHED and BBR treatment for 48 h on the expression levels of BSEP and MRP2 of HepG2 cells ($\bar x \pm s$, n=3)

The protein expression levels were detected by Western blot, and the semi-quantitative analysis was performed. Group A and group B are the same as Figure 1. * P < 0.05, ** P < 0.01, compared with the control group; ## P < 0.01, compared with the EVO or DHED group. EVO, evodiamine; BBR, berberine; DHED, dehydroevodiamine; BSEP, bile salt export pump; MRP2, multidrug resistance-associated protein 2.

如图 3B所示，DHED与小檗碱组中，DHED组BSEP蛋白表达量下降至溶剂对照组的76.8%，差异有统计学意义(P＜0.05)，MRP2蛋白表达量上调至溶剂对照组的1.8倍，差异有统计学意义(P＜0.01)。与DHED组相比，DHED+小檗碱组的BSEP和MRP2蛋白表达量分别下降至溶剂对照组的38.1%和75.9%，提示该实验条件下，小檗碱配伍减轻DHED所致肝毒性的机制可能不涉及胆汁酸转运蛋白的表达调控。

2.4 联合用药对MDA含量和SOD活性的影响

如图 4A所示，EVO与小檗碱组中，与溶剂对照组相比，EVO组MDA含量从每克蛋白质2.10 μmol升高至3.15 μmol，差异有统计学意义(P＜0.01)；与EVO组相比，EVO+小檗碱组MDA含量降低至每克蛋白质2.67 μmol，差异有统计学意义(P＜0.01)。与溶剂对照组相比，EVO组SOD活性从每毫克蛋白质26.23 U降低至24.46 U，差异有统计学意义(P＜0.05)；与EVO组相比，EVO+小檗碱组SOD活性升高至每毫克蛋白质25.68 U，但差异无统计学意义。上述结果表明，该实验条件下小檗碱配伍可减轻EVO导致的脂质过氧化损伤。
图4 EVO、DHED和小檗碱处理48 h对HepG2细胞MDA含量和SOD活性的影响($\bar x \pm s$, n=3)

Figure 4 Effects of EVO, DHED and BBR treatment for 48 h on MDA content and SOD activity of HepG2 cells ($\bar x \pm s$, n=3)

Group A and group B are the same as Figure 1. * P < 0.05, ** P < 0.01, compared with the control group; # P < 0.05, ## P < 0.01, compared with the EVO or DHED group. EVO, evodiamine; BBR, berberine; DHED, dehydroevodiamine; MDA, malondialdehyde; SOD, superoxide dismutase.

如图 4B所示，DHED与小檗碱组中，与溶剂对照组相比，DHED组MDA含量从每克蛋白质2.10 μmol升高至2.34 μmol，差异有统计学意义(P＜0.05)；与DHED组相比，DHED+小檗碱组MDA含量降低至每克蛋白质2.00 μmol，差异有统计学意义(P＜0.05)。与溶剂对照组相比，DHED组SOD活性从每毫克蛋白质26.23 U降低至25.11 U，但差异无统计学意义；与DHED组相比，DHED+小檗碱组SOD活性降低至每毫克蛋白质21.60 U，差异有统计学意义(P＜0.01)。上述结果表明，该实验条件下小檗碱配伍可减轻DHED导致的脂质过氧化损伤。

3 讨论

中药常配伍使用以达到增效、减毒的目的，左金丸是吴茱萸和黄连配伍中的著名方剂。用中药成分配伍研究左金丸的安全性和配伍减毒作用机制是符合中药理论的方法之一。EVO、DHED和小檗碱是左金丸的主要活性成分，有研究表明，黄连和吴茱萸以质量比6 ∶ 1配伍后，EVO等吴茱萸生物碱的溶出率增加[8]；小檗碱吸收加快，达峰时间缩短，峰值血药浓度Cmax增加，相对生物利用度增加，生物半衰期增加，使其在体内的消除减慢[9]；吴茱萸可增加黄连中小檗碱在肝脏中的分布，促进小檗碱的肝脏摄取[10]；配伍后可抑制小檗碱的肝脏代谢[11]。
已有研究表明，EVO和小檗碱联用可增强抗肿瘤和降脂作用[12-13]，且小檗碱具有调节脂质代谢、调节胆汁酸代谢、抗炎、抗氧化等肝保护活性[5]。本研究组的前期研究发现，吴茱萸生物碱EVO和DHED是潜在的肝毒性成分，其毒性机制与脂质过氧化损伤、细胞凋亡和胆汁淤积相关[14]，但其与小檗碱配伍是否具有减毒作用尚未见相关报道。本研究以HepG2细胞为模型，选择吴茱萸的肝毒性成分EVO和DHED与黄连的主要活性成分小檗碱联合用药，从成分配伍角度探讨联合用药对HepG2细胞毒性的影响，初步阐释吴茱萸和黄连配伍的减毒作用及其机制。
CI可用于判断药物联合应用的相互作用，CI＜1、CI=1和CI>1分别表示协同、相加和拮抗作用。本研究中，小檗碱与EVO或DHED联用可分别提高HepG2细胞存活率，其联用的CI值分别为77.89和4.49，均大于1，表明小檗碱配伍对EVO或DHED的肝细胞毒性存在减毒作用。
ALT和AST具有较好的肝组织特异性，肝细胞受损可导致细胞膜通透性增加，引起酶活力升高，通常可结合这两种酶的变化来判断肝损伤情况[15]。LDH在细胞质内表达稳定，通过测定释放出的LDH活性可以评价细胞膜的完整性[16]。本研究结果显示，与溶剂对照组相比，单用EVO组或单用DHED组的ALT、AST和LDH活性均升高，而与小檗碱联用后，ALT、AST和LDH活性均显著降低，表明配伍小檗碱对EVO或DHED导致的HepG2细胞毒性具有减毒作用。
胆汁淤积性肝损伤是一种主要的药物性肝损伤类型。ALP和TBIL是反映胆汁淤积型肝损伤的标志物，当药物引起肝损伤时，胆汁排泄受阻，胆红素代谢降低，可引起ALP活性和TBIL含量升高[17-18]。本研究中，与溶剂对照组比较，单用EVO组或单用DHED组的ALP活性升高、TBIL含量增加，而与小檗碱配伍后，ALP活性降低、TBIL含量减少，表明配伍小檗碱可改善EVO或DHED引起的胆汁淤积。
胆汁淤积性肝损伤发病机制复杂，涉及参与或调控胆汁和胆汁酸合成、摄取、转运等过程的相关分子的表达或功能异常，以及胆管细胞的结构和功能改变等，其中，胆汁酸转运功能异常是胆汁淤积型肝损伤的常见诱因。BSEP位于肝细胞胆管侧膜上，是介导游离或结合型胆汁酸外排的重要转运体[19]。BSEP抑制是药物诱导胆汁淤积型肝毒性常见的机制，目前已有多种药物被报道因抑制BSEP功能、诱发肝毒性从而导致黑框警告(boxed warning)或撤市[20-21]。欧洲药品管理局已建议，在临床前或临床研究过程中需对药物是否抑制BSEP进行评估[22]。MRP2是唯一表达在胆管侧的MRP家族成员，介导有机阴离子以及葡萄糖醛酸和磺酸结合的胆汁酸转运[19]。本研究聚焦于探讨左金丸主要成分对肝细胞中两种胆汁酸转运体(BSEP和MRP2)表达水平的影响，研究结果发现，单用EVO可降低HepG2细胞胆汁酸转运体BSEP和MRP2蛋白表达，单用DHED可降低BSEP蛋白表达，提示EVO或DHED可通过抑制胆汁酸转运体，使胆汁酸在细胞中蓄积，从而导致胆汁淤积的发生。与单用EVO组相比，EVO与小檗碱联用可上调BSEP和MRP2蛋白表达，差异虽无统计学意义，但仍提示联用后小檗碱可能通过上调BSEP和MRP2蛋白的表达，改善EVO引起的胆汁淤积。与单用DHED组相比，DHED与小檗碱联用可下调BSEP和MRP2蛋白的表达，提示药物联用后小檗碱并不能通过调节BSEP和MRP2蛋白表达改善DHED引起的胆汁淤积。已有研究表明，小檗碱可通过改变胆汁酸代谢相关法尼酯X受体、Na+-牛磺胆酸共转运多肽、胆汁酸合成酶CYP7A1和CYP8B1等的表达或活性，发挥胆汁酸代谢调节作用[23-25]，故推测小檗碱可能作用于其他胆汁酸转运体或胆汁酸循环的其他环节，发挥改善胆汁淤积的作用，但仍需进行深入研究。
MDA为脂质过氧化的主要分解产物，通常作为标志物，检测多不饱和脂肪酸过氧化水平[26]，SOD是清除超氧自由基的关键抗氧化酶，其活性在氧化应激时降低[27]，二者均可反映细胞内脂质过氧化水平。本研究中，单用EVO或DHED可增加HepG2细胞内MDA含量，降低SOD活性，提示EVO和DHED可诱导HepG2细胞的脂质过氧化损伤。EVO与小檗碱联用可减少MDA含量，升高SOD活性；DHED与小檗碱联用也可减少MDA含量，但降低SOD活性。既往研究表明，小檗碱可通过增强SOD、过氧化氢酶、谷胱甘肽还原酶活性以及减少ROS产生等发挥抗氧化作用[28-29]，据此推测，小檗碱可能通过改善细胞其他抗氧化功能抑制脂质过氧化，目前尚需进一步的实验验证。上述结果提示，配伍小檗碱可增强细胞的抗氧化能力，减轻EVO或DHED引起的HepG2细胞脂质过氧化损伤。
本研究尚存在一定局限性，如基于前期EVO和DHED肝细胞毒性研究及左金丸中主要成分的Cmax确定联合用药比例，仅分析了两种成分联合用药的肝细胞毒性，后续可增加中药成分的浓度和配伍比例，以及结合左金丸的药代动力学数据增加不同的活性成分进行成分配伍研究，以进一步阐释左金丸配伍的减毒机制。
综上，本研究发现一定配比的小檗碱与EVO或DHED联用对其致HepG2细胞毒性具有减毒作用，其减毒的作用机制与调节肝细胞胆汁酸转运体表达、减轻脂质过氧化损伤有关。

利益冲突  所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明  高亚东、王旗：提出研究思路；王旗、朱安：设计研究方案；高亚东、李璐迪、李盈姿：收集、分析、整理数据；高亚东：撰写论文；王旗：总体把关和审定论文；所有作者均审阅并修改论文。

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