详见表1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 主要实验试剂及仪器 Table 1 List of major experimental reagents and equipment Reagents and equipment Source DMEM basal medium, DMEM/F-12 basal medium, PBS Hyclone, US Fetal bovine serum, serum replacement Gibco, US MatrigelTM basement membrane matrix BD, US PSCeasy culture medium, 0.5 mmol/L EDTA Cellapy, China 4% paraformaldehyde Rongchuang, China Recombinant human growth/differentiation factor-5 (rhGDF-5) Pepro Tech, US Alizarin red S, cetylpyridinium chloride Sigma, US RNeasy MiNi Kit(50) Qiagen, Germany PrimeScriptTM RT master mix, SYBR® Premix Ex TaqTM TaKaRa, Japan FITC labeled goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor®488 labeled goat anti-mouse IgG Zhong Shan Jinqiao, China anti-bone sialoprotein (BSP) antibody, anti-CEMP1 antibody Abcam, UK anti-vimentin antibody SANTA CRUZ, US VECTASHIELD® mounting media with DAPI VECTOR, US Inverted phase contrast microscope Olmpus, Japan Laser scanning confocal microscope Leica, Germany

表1 主要实验试剂及仪器 Table 1 List of major experimental reagents and equipment

本课题组既往已于北京大学干细胞研究中心将人牙龈成纤维细胞成功诱导为iPSCs并于体外连续传代、扩增, 同时冻存保种^[16]。现分别复苏第5, 10, 15, 20代iPSCs, 解冻后1 000 r/min离心5 min以去除冻存液中的二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO), 将细胞接种于0.5%(体积分数)Matrigel包被的培养皿中, 加入PSCeasy多潜能干细胞培养基, 37 ℃, 5%CO₂培养箱中培养, 每天换液, 光学显微镜下观察细胞形态。

分别取生长状况良好的第5、10、15、20代人iPSCs, 经乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)消化制成单细胞悬液计数, 调整细胞浓度为2× 10⁵/mL接种于24 孔板内, 每孔1 mL, 每组3孔, 置37 ℃, 5%(体积分数)CO₂培养箱中培养, 每隔24 h收集每组3孔细胞, 分别计数活细胞并取平均值。一次传代内连续测定5 d, 以培养时间为横坐标, 以细胞数量(× 10⁶/mL)为纵坐标绘制生长曲线。

1.4.1 拟胚体(embryonic bodies, EBs)的获得 5 d 后细胞克隆即增殖到约80%融合, EDTA 37 ℃消化2~3 min吹打成细胞悬液, 以1× 10⁵/皿的密度均匀接种于未铺胶的悬浮培养皿, 其中EB培养基为DMEM/F12(含体积分数20%血清替代物、0.1% β -巯基乙醇, 1% L-谷氨酰胺、1%非必需氨基酸), 37 ℃5%(体积分数)CO₂培养箱中继续培养3~5 d, 隔天换液。

1.4.2 牙周定向诱导 将拟胚体接种于0.5% (体积分数)Matrigel包被过的培养皿中, 每皿接种约15个拟胚体, 牙周诱导培养基为DMEM/F12(含体积分数20%胎牛血清及200 μ g/L rhGDF-5), 同时设置未诱导的自发分化组作为阴性对照, 培养基为DMEM/F12(含体积分数20%胎牛血清), 均于37 ℃, 5%(体积分数)CO₂培养箱中培养14 d, 隔天换液。

各代次诱导组及对照组分化14 d后, 弃培养液, PBS洗3遍, 4%(质量分数)多聚甲醛固定30 min, PBS漂洗3遍, 1%(质量分数)茜素红溶液(pH=4.5)常温染色20 min, PBS漂洗3遍, 光学显微镜下直接观察矿化结节的形成。

PBS孵育15 min后弃上清, 加入100 mmol/L氯化十六烷基吡啶, 室温下孵育1 h溶解矿化结节。分光光度计检测562 nm处上清的光密度值; 氯化十六烷基吡啶溶液调零, 同时测定一组未加茜素红的单纯细胞上清液光密度值, 最终样本测定值=含茜素红上清光密度值-单纯细胞光密度值, 每个样本重复3次, 比较各代次间钙盐沉积量的差异。

1.6.1 细胞RNA提取 各代次诱导组及对照组分化14 d后, 使用RNeasy MiNi Kit试剂盒提取各样本的RNA。

1.6.2 RNA质量检测 使用无RNA酶H₂O将分光光度计调零, 取1 μ L RNA溶液加入49 μ L无RNA酶H₂O充分混匀, 分光光度计上读取260 nm与280 nm处光密度的比值, 以确定RNA溶液的纯度, 比值范围为1.8~2.1。

1.6.3 mRNA反转录 PrimeScript^TM RT Master Mix试剂盒进行RNA反转录, 得到的cDNA保存于-20 ℃中待用。

1.6.4 实时定量聚合酶链式反应 实时荧光定量PCR检测各样本向牙周方向分化过程中相关基因的表达, 包括成骨方向的骨钙蛋白(osteocalcin, OCN)和骨涎蛋白(bone sialoprotein, BSP), 成牙周膜结缔组织方向的骨膜蛋白(periostin)和波形蛋白(vimentin), 以及成牙骨质方向的牙骨质附着蛋白(cementum attachment protein, CAP)和牙骨质蛋白1(cementum protein 1, CEMP1)^{[17, 18, 19]}。按20 μ L总反应体系加入上下游引物(表2)、cDNA模板及各反应试剂, 包括SYBR® Premix Ex Taq^TM 10 μ L, 上下游引物各0.8 μ L, ROX Reference Dye(50× )0.4 μ L, 模板2 μ L, 6 μ L dH₂O补齐, 充分混匀, 利用cDNA作为模板扩增牙周特异性基因, GAPDH作为对照。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 人牙周相关基因引物序列 Table 2 List of primer sequences used for qRT-PCR Primer Forward Reverse GAPDH 5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3' 5'-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3' OCN 5'-GCGCTCTGTCTCTCTGACCT-3' 5'-GCCGGAGTCTGTTCACTACC-3' BSP 5'-CAGGGAGGCAGTGACTCTTC-3' 5'-AGTGTGGAAAGTGTGGCGTT-3' Periostin 5'-TGGAGAAAGGGAGTAAGCAAGG-3' 5'-TTCAAGTAGGCTGAGGAAGGTG-3' Vimentin 5'-GGGACCTCTACGAGGAGGAG-3' 5'-CTGTCCTACAACTGTTACGC-3' CAP 5'-CTGCGCGCTGCACATGG-3' 5'-GCGATGTCGTAGAAGGTGAGCC-3' CEMP1 5'-GGGCACATCAAGCACTGACAG-3' 5'-CCCTTAGGAAGTGGCTGTCCAG-3' OCN, osteocalcin; BSP, bone sialoprotein; CAP, cementum attachment protein; CEMP1, cementum protein 1.

表2 人牙周相关基因引物序列 Table 2 List of primer sequences used for qRT-PCR

分化第14天, 诱导组及对照组各代次细胞用4%(质量分数)多聚甲醛固定15 min, 0.2%(质量分数)Tritonx 100室温反应15 min, 3%(质量分数)牛血清白蛋白(BSA)封闭30 min。分别加入1 ∶ 100稀释的第一抗体, 包括抗骨涎蛋白抗体 (anti-bone sialoprotein antibody)、抗波形蛋白抗体 (anti-vimentin antibody) 和 抗牙骨质蛋白1抗体 (anti-CEMP1 antibody), 4 ℃孵育过夜。PBS洗3次, 每次10 min, 分别加入1 ∶ 200稀释的第二抗体, 包括FITC标记山羊抗兔IgG及Alexa Fluor®488标记山羊抗小鼠IgG, 37 ℃避光孵育2 h。细胞核用VECTASHIELD®Mounting Media with DAPI染色, 激光共聚焦扫描显微镜观察拍照, Image J软件分析, 比较各代次荧光强度的差异。

使用SPSS 19.0软件进行统计学分析, 计量资料的描述用均数± 标准差表示, 对于相同培养条件下4组不同代次的细胞, 采取单因素方差分析和Student Newman Keuls(SNK)法两两比较; 对于相同代次细胞在诱导组和对照组间的比较采用双侧t检验, P< 0.05认为差异有统计学意义。

复苏后的人iPSCs多于1~2 h内贴壁, 各代次细胞增殖迅速, 第5~6天融合度即达80%。各代次iPSCs在无饲养层细胞培养条件下均贴壁良好, 呈克隆集落样生长, 结构均匀, 形态典型, 多呈岛状或巢状。

图1

Figure 1

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	图1 不同代次iPSCs的细胞形态Figure 1 Morphological characterization of iPSCs at different passages

生长曲线显示, 第5、10、15及20代人iPSCs体外扩增的速度相似, 在一次传代内均未出现平台期, 为快速增长型细胞, 群体倍增时间约为24 h。细胞均有较强的分裂增殖能力, 其中以第10代增殖能力最强、第15代增殖能力稍弱, 但各时间点的细胞数目差异无统计学意义(P> 0.05), 表明人iPSCs在多次传代后仍可保持较高增殖活性。

各代次人iPSCs均可形成相近数量和大小的拟胚体, 贴壁后随分化时间延长, 细胞形态由克隆细胞簇渐变为成纤维样细胞集落, 呈长梭形或多角形平行排列或旋涡状生长, 逐渐汇集, 最终连接成片。

图2

Figure 2

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	图2 不同代次人iPSCs的生长曲线Figure 2 Growth curves of iPSCs at different passages

图3

Figure 3

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	图3 不同代次人iPSCs形成的拟胚体Figure 3 Morphology of embryonic bodies formed by iPSCs at different passages

图4

Figure 4

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	图4 不同代次人iPSCs牙周定向分化后的细胞形态Figure 4 Morphology of iPSCs at different passages upon periodontal differentiation

第5、10、15、20 代人iPSCs经牙周定向诱导14 d后, 茜素红染色均可见较多“ 矿化” 结节形成, 界限较清, 外围呈橘红色, 中心呈深褐色, 而自发分化对照组几乎未见矿化结节生成。钙含量半定量结果显示, 相同代次的细胞中, 诱导组表达均高于对照组, 且差异有统计学意义(P5:t=2.125, P=0.003; P10:t=2.246, P=0.021; P15:t=3.754, P=0.004; P20:t=3.933, P=0.002), 但相同诱导条件下, 不同代次细胞(P5、P10、P15、P20)在562 nm处平均光密度值的差异无统计学意义(牙周定向诱导组:F=2.365, P=0.109; 自发分化对照组:F=2.901, P=0.067), SNK法进一步两两比较, 任意两组间差异无统计学意义。

图5

Figure 5

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	图5 不同代次人iPSCs牙周定向诱导14 d后的茜素红染色Figure 5 Alizarin Red staining of iPSCs at different passages upon periodontal differentiation

图6

Figure 6

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	图6 茜素红半定量检测诱导组和对照组不同代次人iPSCs的钙盐沉积情况Figure 6 The relative optical density of spontaneous and periodontal differentiated iPSCs at different passages

第5、10、15、20 代人iPSCs分别自发分化及牙周定向诱导14 d后, qRT-PCR检测牙周相关基因表达, 包括成骨方向的骨钙素及骨涎蛋白, 成牙周膜结缔组织方向的骨膜蛋白及波形蛋白, 成牙骨质方向的牙骨质附着蛋白及牙骨质蛋白1, 结果显示骨膜蛋白在对照组亦有较高表达, 但相同代次的细胞中诱导组各牙周相关基因的表达均高于对照组, 且差异有统计学意义(P< 0.05)。诱导组细胞在第15代成骨相关基因、第10代成牙周膜相关基因及第20代成牙骨质相关基因的mRNA表达水平上较其他代次偏低, 在培养条件一定的前提下, 不同代次细胞(P5、P10、P15、P20)间mRNA的相对表达水平间差异无统计学意义(表3)。

图7

Figure 7

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	图7 qRT-PCR检测诱导组及对照组不同代次iPSCs牙周相关基因的相对表达Figure 7 The relative periodontal tissue gene expression of spontaneous and periodontal differentiated iPSCs at different passages by qRT-PCR

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 不同代次细胞间牙周相关基因相对表达的单因素方差分析结果 Table 3 The univariate analysis results of relative periodontal tissue gene expression of iPSCs at different passages Items OCN BSP Periostin Vimentin CAP CEMP1 Periodontal differentiation 0.056 0.082 0.103 0.092 0.114 0.452 Spontaneous differentiation 0.207 0.058 0.062 0.159 0.364 0.133 OCN, osteocalcin; BSP, bone sialoprotein; CAP, cementum attachment protein; CEMP1, cementum protein 1.

表3 不同代次细胞间牙周相关基因相对表达的单因素方差分析结果 Table 3 The univariate analysis results of relative periodontal tissue gene expression of iPSCs at different passages

第5、10、15、20代iPSCs经牙周定向诱导分化14 d后, 牙周相关蛋白BSP、 波形蛋白及CEMP1染色均为阳性, 细胞质呈绿色荧光, 细胞核经DAPI染色呈蓝色荧光。对照组中仅第5及15代波形蛋白染色呈弱阳性, 这与同为牙周膜相关标记的骨膜蛋白在自发分化组有较高表达的qRT-PCR结果趋于一致; Image J软件分析相同代次细胞中, 诱导组各牙周相关蛋白荧光强度均高于对照组, 且差异有统计学意义(P< 0.05); 在诱导组中第20代CEMP1荧光偏弱, 不同代次细胞(P5、P10、P15、P20)间荧光强度的差异并无统计学意义(BSP:F=0.927, P=0.450; vimentin:F=0.917, P=0.455; CEMP1:F=2.129, P=0.137)。

图8

Figure 8

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	图8 激光共聚焦扫描显微镜示诱导组及对照组不同代次iPSCs牙周相关蛋白的表达Figure 8 Confocal images displaying the expression of periodontal tissue specific markers of spontaneous and periodontal differentiated iPSCs at different passages