肿瘤的发生和发展是一个动态的连续过程, 肿瘤细胞会随着环境的变化而不断出现基因和表型的改变, 如上皮-间质转换(epithelial-mesenchymal transition, EMT), 从而使自身更好地适应和利用周围环境, 不断演进并完成侵袭、转移过程。肿瘤细胞可以和周围微环境中各种宿主因素发生互动, 适应或改变周围环境以满足自身发展的需要。

原发瘤部位微环境是肿瘤发生的最初部位, 最适合肿瘤细胞的生存和生长, 但与正常器官组织的微环境相比, 一旦发生肿瘤, 该部位的微环境仍然会发生变化, 最明显的是原发瘤内部及周边的组织中出现不同程度的炎症反应。目前的研究已经明确慢性炎症与肿瘤的发生及发展关系密切, 许多炎性介质, 如肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α , TNF-α )、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GMCSF)及各种白细胞介素(interleukin, IL)等, 均在肿瘤演进及侵袭中发挥不同作用^[3]。

原发瘤微环境中存在着多种宿主细胞, 包括肿瘤相关纤维母细胞(tumor-associated fibroblasts)、浸润的免疫/淋巴细胞、骨髓来源的间充质干细胞、血管/淋巴管内皮细胞及由这些细胞产生的各种生长因子/生长抑制因子、炎症介质、细胞因子、趋化因子、血管生成促进/抑制因子、促侵袭因子等, 还有非细胞形态物质, 如细胞外基质的各种成分及其降解产物, 这些成分会通过各种机制直接或间接影响肿瘤细胞生长、新生血管生成、免疫逃逸以及侵袭和转移。有研究提示, 这些成分的组成及时间和空间分布的变化也会影响临床治疗效果, 与患者预后有密切关系, 比如人们发现肿瘤细胞自身分泌或诱导周围炎症细胞分泌多种炎症性细胞因子(如IL-1、IL-6、TNF-α )以及多种趋化因子及其受体[如趋化因子受体4(chemokine receptor 4, CXCR4)、 C-C趋化因子受体7(C-C chemokine receptor 7, CCR7)等], 从而促进肿瘤的侵袭、转移^[4]。不同的M1或M2表型的巨噬细胞在调节肿瘤局部免疫反应中发挥不同作用, 进而影响肿瘤侵袭和转移的不同结局, 说明免疫调节网络的精确性及复杂性。

即使在肿瘤组织内部, 不同部位的微环境也有明显差异。恶性肿瘤由于生长迅速, 靠近中心部位经常会处于缺血缺氧状态甚至发生出血坏死。在缺氧状态下, 肿瘤细胞可以通过不同信号通路的激活促进一些转录因子[如低氧诱导因子1(hypoxia-inducible factor 1, HIF-1)等]的活化来增加许多促血管生成因子[如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)等]的合成和分泌, 增加肿瘤的血液供应以及转移的风险。此外, 缺氧与肿瘤干细胞的产生有密切关系, 缺氧状态下Notch的配体Jagged2表达增高, 进而引起EMT并促进乳腺癌干细胞生长。与之相对应, Jagged2表达增高及Notch通路的激活已被证实与乳腺癌患者肿瘤转移及不良预后相关。我们的早期研究发现, 在正常氧状态下, bFGF可诱导缺氧诱导因子HIF-1α 的表达, 进而促进VEGF的分泌; 而在缺氧状态下, bFGF在HIF-1α 的协同作用下, 其促血管生成作用进一步加强, 其中PI-3K/Akt信号通路可能起重要作用^{[5, 6]}。

在肿瘤的周边部位, 尤其是肿瘤侵袭的前缘, 是肿瘤细胞与宿主细胞及细胞外间质相互作用最激烈的部位, 也是EMT表现最明显的地方。多种宿主细胞, 如肿瘤相关纤维母细胞、浸润的免疫/淋巴细胞、肿瘤相关巨噬细胞/树突状细胞等, 与肿瘤细胞及脱离原发瘤的肿瘤细胞直接接触并活化产生各种因子, 引起肿瘤细胞发生一系列变化。细胞的破坏使许多细胞内的酶或因子释放出来, 而细胞外基质的降解破坏导致许多原来结合于细胞外基质的生长因子[如转化生长因子-β (transforming growth factor-β , TGF-β )等]被游离出来发挥作用。EMT使得肿瘤细胞更具有运动及侵袭能力, 这里也是肿瘤干细胞产生和聚集的场所。具有移动能力的肿瘤干细胞被认为是转移细胞的重要起始细胞, 而EMT也被认为与肿瘤干细胞产生有密切关系^[7]。

转移靶器官部位的微环境完全不同于肿瘤的原发生长环境。正常情况下, 细胞很难在另一个器官组织中生存, 更不用说生长了。肿瘤细胞在靶器官中之所以能够生存并生长形成转移瘤, 其机制仍不清楚, 一方面不同肿瘤对不同器官组织的亲和力有明显差异, 如乳腺癌最容易转移至肺、骨、脑, 肺癌容易转移至肝、脑, 大肠癌转移的靶器官是肝, 前列腺癌转移的靶器官是骨, 另一方面, 即使这种亲和力存在, 肿瘤细胞仍然需要克服多种障碍才能形成转移瘤。目前已发现几种决定肿瘤细胞亲和力的因素, 其中转移瘤细胞与靶器官微循环血管内皮细胞之间黏附分子的识别及相互作用是重要因素之一。这种识别使瘤细胞停着于靶器官毛细血管床, 进一步的相互作用使瘤细胞穿过内皮细胞屏障进入组织。例如肿瘤细胞表达的整合素α ₆β ₄可与肺部血管内皮细胞上的钙激活氯通道(calcium-activatedchloride channel, CLCA)结合, 使肿瘤细胞在肺部停留, 并形成转移灶^[8]。破骨细胞的激活对肿瘤的骨转移至关重要, 肿瘤特异性的α _Vβ ₃可通过募集激活的破骨细胞以及增强趋化性和趋触性迁移来促进乳腺癌细胞的自发骨转移^[9]。

近年来有一种新的理论— — “ 转移前壁龛” (pre-metastatic niche)可以部分解释转移瘤是如何在靶器官形成的^[10]。肿瘤细胞在到达靶器官之前可以分泌某些因子, 如VEGF、胎盘生长因子(placental growth factor, PIGF)、FGF等, 这些因子以分泌小体(exosome)的形式先于肿瘤细胞到达靶器官, 并对靶器官微环境进行改造, 使之变得适合于后来的肿瘤细胞的生存。肿瘤细胞也可通过分泌小体动员骨髓中的一些细胞, 如骨髓来源的间充质干细胞(bone marrow derived cells, BMDC, 通常表达VEGF受体)先于肿瘤细胞到达靶器官, 并对靶器官微环境进行改造, 经过这些改造, 肿瘤细胞在靶器官的生存及成瘤能力大大提高。因此, 如何阻断“ 转移前壁龛” 的形成, 有可能成为抑制转移瘤形成的有效策略。

由于血管/淋巴管系统中免疫细胞及抗体的存在, 再加上液体剪切力的作用, 使得绝大部分进入血管/淋巴管系统的肿瘤细胞被破坏或清除。肿瘤细胞可以通过自身形成细胞团或与血小板形成小血栓的形式抵抗这种破坏, 有实验数据表明, 形成血栓或细胞团的肿瘤更容易形成转移灶。

肿瘤患者外周血及骨髓中存在的肿瘤细胞分别被称为循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTC)或播撒肿瘤细胞(disseminated tumor cells, DTC), 现在已经可以通过多种方法检测, 正在成为临床判断肿瘤患者复发/转移、临床疗效及预后的重要指标^[11]。CTC/DTC往往EMT更明显, 同时带有肿瘤干细胞样标记的细胞比例也更高。

ATP究竟在体内具有哪些功能?自1929年Lohmann 发现ATP分子以来, ATP及其相关的核苷酸在调节酶活性、离子通道功能、能量代谢及核酸合成中的重要作用不断被揭示。随着研究的深入, 人们发现释放到细胞外的ATP还具有多种重要生理/病理功能。ATP是重要的信号分子, 在各种外周组织和中枢神经系统产生不同的效应, 包括参与快速激动型神经传导及发育, 参与伤害感受、听觉、视觉、味觉功能, 参与凋亡级联反应、骨关节病的发生、血小板凝集、平滑肌收缩/舒张及免疫反应, 调节肺及心血管功能, 调节星形细胞等^[16]。近年来还发现, ATP也参与长效的生物学行为调节, 如细胞增殖、分化、迁移以及死亡。

正常情况下细胞外ATP浓度(μ mol/L)要远小于细胞内(3~5 mmol/L), 并维持一种平衡状态。在某些病理情况下, 如炎症、缺氧或组织重塑等造成细胞损伤破坏, 细胞内ATP会大量释放到细胞外, 引起细胞外微环境中ATP浓度短暂迅速增加。此外, 许多细胞在缺氧、机械/化学刺激时可通过胞吐、小泡转运的方式释放ATP。最近还有P2X7受体可直接参与介导ATP释放的报道^[17]。释放到细胞外的ATP存在时间较短, 通常会在外核苷酸酶(ecto-nucleotidase)的作用下迅速降解为二磷酸腺苷(adenosine diphosphate, ADP)、一磷酸腺苷(adenosine monophosphate, AMP)及腺苷(adenosine)。外核苷酸酶中的外三磷酸核苷二磷酸水解酶(ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolases, 主要是CD39)、外核苷焦磷酸酶(ecto-nucleotide pyrophosphatase)和磷酸二酯酶水解ATP为ADP和AMP, 后者被CD73进一步水解为腺苷。肿瘤微环境中, 由于炎症反应、缺氧造成细胞损伤以及肿瘤侵袭造成组织破坏, 使ATP大量出现在细胞外间隙中, 其浓度(约100 μ mol/L)要高于正常细胞外ATP浓度^[18], 如此高浓度的ATP对肿瘤微环境的影响值得被关注。

细胞外ATP主要通过细胞膜上相应的受体发挥作用, 这些受体被称之为嘌呤受体(purinergic receptor或purinoceptor)。Burnstock^[16]首次系统描述了嘌呤受体并将其分为P1和P2受体两大类。

P1受体:其主要的天然配体是腺苷, 又称腺苷受体, 分为A1、A2A、A2B和A3四个亚型, 均与G蛋白偶联。

P2受体:主要是ATP受体, 可进一步分为P2X和P2Y两大类。(1)P2X受体为配体门控型离子通道(ligand-gated ion channel, LGIC)受体, 已有7种亚型被克隆(P2X1~P2X7), P2X受体对Na⁺、K⁺、Ca²⁺通透, 一旦被激活, 即引起细胞的去极化及兴奋。P2X受体主要对ATP起反应。(2)P2Y受体属于G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor, GPCR), 以具有典型的7次跨膜结构为特征, 迄今已有8种有功能的哺乳动物P2Y受体(P2Y1、P2Y2、P2Y4、P2Y6、P2Y11、P2Y12、P2Y13、P2Y14)被克隆。P2Y受体可被多种核苷/核苷酸激活, 包括ATP、ADP、二磷酸尿苷(uridinediphosphate, UDP)及UDP葡萄糖。从药理学特性方面看, P2Y受体可被进一步区分为:腺嘌呤核苷酸受体P2Y1、P2Y11、P2Y12、P2Y13, 主要由ATP激活; 尿嘧啶核苷酸受体P2Y4、P2Y6、P2Y14, 主要由三磷酸尿苷(uridine triphosphate, UTP)、UDP或者UDP葡萄糖激活。另外, P2Y2受体等同地被ATP、UTP激活。从系统分类以及结构、信号通路方面看, P2Y受体分为两个亚家族:①P2Y1家族, 包括P2Y1、P2Y2、P2Y4、P2Y6、P2Y11, 其同源性为35%~52%, 其中P2Y11与其他4种受体的同源性仅为28%~30%, 它们共同偶联于Gq, 参与激活磷脂酶C(phospholipase C, PLC)。②P2Y12家族, 包括P2Y12、P2Y13、P2Y14, 其基因共同定位于染色体3上的一个基因群, 其同源性为45%~55%, 偶联于Gi/o, 参与抑制腺苷酸环化酶的活性。

P2Y受体具有GPCR的共性, 即受体活性与所偶联的G蛋白类型密切相关。当P2Y受体与细胞外激动剂结合后, 通过与G蛋白偶联激活一系列信号通路。通常根据与不同的G蛋白偶联而分成两组:P2Y1、P2Y2、P2Y4、P2Y6和P2Y11 受体与Gq偶联, 激活PLCβ ; 而P2Y12、P2Y13和P2Y14受体与Gi偶联, 抑制腺苷酸环化酶。

2.4.1 与1, 4, 5-三磷酸肌醇通路相偶连, 激活PLC 通过对百日咳毒素不敏感的G蛋白Gq/11激活PLCβ , 使磷脂酰4, 5-二磷酸肌醇(phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate, PIP2)分解为1, 4, 5-三磷酸肌醇(inositol-1, 4, 5-trisphospate, IP3)和二酰基甘油(diacyl glycerol, DAG)。IP3促使内质网钙库释放Ca²⁺, 使细胞内Ca²⁺浓度升高, 进而激活蛋白激酶C(protein kinase C, PKC); DAG也可以激活PKC。

2.4.2 腺苷酸环化酶的抑制和/或激活 通过对百日咳毒素敏感的G蛋白Gi/o参与对腺苷酸环化酶的抑制和激活, 从而调节环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)的水平, 引起蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)的抑制和激活。

2.4.3 激活丝裂原活化蛋白激酶 通过激活非受体型酪氨酸蛋白激酶(如Src)、受体型酪氨酸激酶(receptor tyrosine protein kinase, RTK), 以及通过Ras依赖的、Ras不依赖的而Raf依赖的PKA、PKC等途径激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路。

2.4.4 通过第二信使调节其他酶的活性 P2Y受体通过第二信使还可以调节其他一些酶的活性, 如磷脂酶A2、一氧化氮合酶等, 也会通过影响多种信号分子的产生, 如前列环素(prostaglandin I2, PGI2)、内皮源性舒张因子(endothelium derived relaxing factor, EDRF)以及NO等, 调节多种生理功能。

2.4.5 参与对多种离子通道的调节 P2Y受体参与了N 型Ca²⁺通道、M型K⁺通道、Ca²⁺依赖的C1^-通道和Ca²⁺依赖的K⁺通道的调节, 但其对离子通道的调节机制尚不清楚。某些离子通道是通过细胞内Ca²⁺调节的, 因此, 当细胞内的Ca²⁺升高时, 就会将受体介导的IP3信号通路与离子通道的激活联系起来, 但在许多神经细胞和非神经细胞, P2Y受体对K⁺通道的调节又是直接进行的, 其中可能包括了G蛋白的β 和γ 亚单位。P2Y受体所激活的下游信号通路不仅依赖于P2Y受体亚型, 也因细胞类型的不同而异。通过这些信号参与多种功能的调节, 如血小板聚集、上皮细胞离子通道的激活、粒细胞的分化、调节血管张力等。

2.5.1 实验动物体内的抗肿瘤研究 关于ATP对肿瘤作用的研究始于上世纪80年代。Rapaport^[19]首先在体内实验中发现ATP可以抑制动物肿瘤细胞的生长, 小鼠接种肿瘤细胞后, 每日给予腹腔注射ATP, 结果发现ATP具有抑制肿瘤生长、抑制带瘤动物体重下降并延长动物生存期的效果。此后多项研究在不同类型肿瘤模型上得出了类似的结果。随后的裸鼠体内实验也证实ATP能抑制人肿瘤细胞的生长, 与经典化学药物治疗和放射治疗相结合用于肿瘤治疗具有协同效应, 其抗肿瘤作用已得到广泛证实。

2.5.2 抗肿瘤效应的体外实验 ATP及其类似物在几乎所有主要类型人类肿瘤细胞系(如大肠、肺、食道、脑、头颈、宫颈、乳腺、卵巢、黑色素瘤等)体外实验中都表现出明显地抑制肿瘤细胞生长的效应。更为重要的是, ATP仅对晚期恶性肿瘤细胞具有很强的抑制作用, 但其对正常细胞几乎没有毒性。例如, 我们研究组曾报告ATP能够明显抑制雄激素非依赖性人前列腺癌细胞系(PC-3、DU145、PC-3M)的生长, 但对雄激素依赖性人前列腺癌细胞系(LNCaP)却没有明显影响^[12]。

2.5.3 人体临床试验 由于ATP表现出良好的抗肿瘤活性而进入临床试验, 经Ⅰ 、Ⅱ 、Ⅲ 期主要针对非小细胞肺癌的临床试验发现, 单独给予ATP并未导致明显肿瘤消退, 但确实可以通过减少体重下降而延长部分肺癌患者(主要是Ⅲ B期)的生存期。到目前为止, 临床试验的总体结论是:全身使用ATP是安全的, 与其他抗肿瘤治疗方法联合使用具有一定前景^[20]。

本研究组曾报道, ATP可以促进前列腺癌细胞的体外侵袭能力^{[14, 15]}。ATP处理前列腺癌细胞(PC-3、DU145、PC-3-1E8、PC-3-2B4)后短时间内就可出现以下变化:微丝染色免疫荧光实验显示在几分钟内细胞伪足明显增多, 6 h内就有明显的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)表达改变; Matrigel体外侵袭实验显示, 数小时内细胞侵袭能力明显增强, 实验结果经多次重复予以确认。对其他类型肿瘤, 如A549(肺癌)、LoVo(大肠癌)、WM983a(黑色素瘤)、Hela(宫颈癌)、MCF-7(乳腺癌)等, ATP 均表现出明显地刺激侵袭的能力, 说明ATP促侵袭作用具有普遍性。考虑到ATP在肿瘤局部微环境中大量存在, 因此, 该结果提示ATP在肿瘤微环境中可能是一个尚未被重视, 但很可能具有重要作用的促侵袭因子。

细胞伪足长短数量的变化往往是细胞运动状态的写照, 伪足数量的增多、长度的增加反映出细胞运动能力的增强。丝状伪足被认为是细胞的触手, 可以感知外界信号, 确定运动方向; 片状伪足是细胞运动的先驱, 带动细胞运动。据文献报道, Cdc42 和Rac1的激活分别与细胞的丝状伪足和片状伪足形成有关^[21]。

Rac1和Cdc42是很重要的两个Rho G蛋白家族成员, 与这个家族其他成员一样, 其蛋白存在着两种形式, 一种是与三磷酸鸟苷(guanosine triphosphate, GTP)结合的激活形式, 另一种是与二磷酸鸟苷(guanosinediphosphate, GDP)结合的失活形式。现今被人们认识的Rho蛋白家族成员有20多个, 可以分为6类, 它们的激活状态被至少3类调控蛋白所调节, 即Rho鸟苷酸交换因子(guanine nucleotide exchange factor, GEF)、RhoGTP酶激活蛋白(GTPase-activating protein, GAP)和Rho鸟苷酸分离抑制因子(guanine nucleotide dissociation inhibitor, GDI), 其中GEF促进Rho蛋白激活, 而后两种则起抑制作用。这个家族中很多成员都参与对微丝和微管的组装以及细胞运动的调节。

Rac1和Cdc42是Rho蛋白家族中被研究得比较深入的分子, 它们通过对细胞微丝骨架的调节直接影响着细胞的运动、极性、黏附等重要活动。文献报道, Cdc42主要参与调节细胞的极性(包括上皮的极性、运动的极性和细胞分裂的极性), 调节细胞微丝骨架的组装、丝状伪足和轴突髓鞘的形成等, 而Rac1的主要功能是调节片状伪足的伸展、微丝骨架的组装及细胞黏附、吞噬等过程^[21]。

从我们的实验结果可以看到, ATP刺激使得前列腺癌细胞片状和丝状伪足的数量以及长度都明显增加^[15]。然而ATP所激活的Rho G蛋白分子却不相同, 这也再次验证了肿瘤细胞遗传背景的复杂与多样性。不同的细胞表型(基因背景以及细胞内信号网络环境)决定着细胞对刺激的不同反应方式, 即使由同一刺激引起的相似效果所经由的信号途径也是千差万别。在DU-145细胞, 没有检测到与2B4相同的Rac1和Cdc42蛋白的激活, 但其明显的伪足形态和数量的改变提示可能有其他类型的Rho蛋白家族分子(如Rif、RhoD等)参与这一过程。

众所周知, 肿瘤细胞在转移过程中需要降解细胞外基质, 这一过程依赖于多种肽链内切酶的参与, 而MMP就是其中被研究得最多的一种。有研究报道, ATP可以引起子宫内膜间质细胞MMP表达的增加, 还可以促使主动脉平滑肌细胞和单核细胞释放MMP。笔者曾研究ATP对前列腺癌细胞MMP活性的影响, 发现ATP不影响最常见的MMP-2和MMP-9的活性, 但可以增强MMP-3和MMP-13的表达; 在2B4和1E8细胞, ATP主要是引起MMP-3表达的上调, 而在DU-145细胞, 则对MMP-3和MMP-13的表达均有促进作用^[15]。这一差异可以解释为, 由于不同肿瘤细胞之间细胞内微环境的不同决定了传导相同刺激的途径不同, 从而最终导致不同的结果。

进一步研究ATP在调节MMP表达中涉及的信号传导通路, 发现PI3K/AKT和细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK1/2)通路在不同前列腺癌细胞中的作用存在差异^[14]。在2B4和1E8细胞, ATP促侵袭作用主要由PI3K/AKT通路介导, 而在DU-145细胞, 此作用由PI3K/AKT和ERK1/2通路所共同参与。我们还发现, 在不同前列腺癌细胞中这两条通路对ATP促前列腺癌细胞MMP表达的影响也有差异:对DU-145细胞而言, MMP-3的表达上调是PI3K/AKT和ERK1/2通路共同作用的结果, 而MMP-13的上调主要由PI3K/AKT通路参与。PI3K/AKT通路参与1E8细胞ATP促MMP-3的表达, 对2B4细胞中ATP上调MMP-3却没有明显影响。总而言之, 我们的研究发现PI3K通路的激活在ATP促前列腺癌细胞侵袭过程中的作用十分显著, 而ERK1/2通路的作用在不同细胞却不尽相同。

正常情况下, 细胞表面会表达多种ATP受体。我们在前列腺癌细胞表面发现各种受体亚型的表达呈现明显异质性, 其中表达最普遍且表达水平较高的是P2Y1、P2Y2、P2Y11和P2X7受体。根据相关功能实验结果, 我们首先选择P2Y2作为主要对象进行相关机制研究, P2Y2 受体的主要激动剂是ATP和UTP, 100 μ mol/L UTP与同剂量ATP一样, 能够促进前列腺癌细胞的体外侵袭和迁移。应用RNA干扰技术将P2Y2受体敲低, ATP和UTP的促侵袭/促迁移的作用被明显抑制^[22], 说明P2Y2受体是ATP促侵袭作用的主要介导受体。

应用基因表达芯片筛选技术, 我们得到多组ATP作用后肿瘤细胞差异表达的基因, 对其中32个可能与肿瘤侵袭和转移密切相关的基因进行real-time PCR及Western blot验证, 结果发现, ATP刺激可以明显上调IL-8和Snail的表达, 下调上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)和紧密连接蛋白(claudin-1)的表达^[22]。

ATP刺激肿瘤细胞后, EMT相关基因的表达出现明显变化, 表现为Snail的表达上调, E-cadherin和claudin-1的表达下调, 同时肿瘤细胞侵袭能力明显增强。应用RNA干扰技术将P2Y2受体敲低, ATP促EMT的作用被明显抑制, 肿瘤细胞的侵袭能力也明显下降, 说明ATP的促侵袭作用主要通过诱导EMT实现。

P2Y2受体属于GPCR, 可通过反式激活(transactivation)的方式激活受体型酪氨酸蛋白激酶受体表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)^[23]。已有实验证实, GPCR引发的细胞迁移需要EGFR的参与, 其机制可能为:GPCR通过激活MMP, 使原本结合于细胞表面或细胞外基质的肝素结合表皮生长因子(heparin binding epidermal-like growth factor, HB-EGF)释放出来, 与EGFR相互作用。P2Y受体激活后, 通过吸引非受体型酪氨酸蛋白激酶Src磷酸化EGFR使之激活。

我们的研究发现, ATP和UTP均能激活前列腺癌细胞中EGFR以及ERK1/2激酶。敲低P2Y2受体或用EGFR的特异性抑制剂AG1478处理细胞, 可明显抑制ATP对ERK1/2激酶的活化, 同时ATP的促侵袭作用也被明显抑制^[24], 说明P2Y2受体除了自身介导的信号传导通路外, 与EGFR的相互作用也是一条重要的通路。由于EGFR在多种肿瘤中均有表达增强的情况, 这种相互作用也为进一步认识P2Y2受体在肿瘤中的作用提供了线索。

体外实验已经提供了充足的证据证实ATP的促侵袭作用, 为了验证其在体内的作用, 我们采用裸鼠移植瘤模型进行体内观察^[22]。结果显示, 皮下接种肿瘤细胞后, 对照组肿瘤与周围的肌肉和脂肪组织界限不清, 侵袭明显, 50%发生了肝转移; 但在敲低P2Y2的两组动物中, 移植瘤与周围组织界限清楚, 且所有裸鼠均未发生肝转移。同时, 实验组肿瘤中Snail的表达量下降, E-cadherin和claudin-1的表达量上升, 说明阻断P2Y2受体可以明显抑制前列腺癌体内侵袭和转移过程, 也为ATP的促侵袭转移作用提供了最直接的证据。

此外, 不仅在前列腺癌模型中, 对乳腺癌的研究也同样揭示了ATP诱导EMT, 具有促进肿瘤细胞迁移及侵袭的作用(结果待发表)。

前面曾提到, ATP受体的另一个亚型— — 离子通道型P2X7受体也在前列腺癌细胞中高表达。采用同样的研究方法, 我们发现ATP刺激可显著促进前列腺癌细胞的体外迁移和侵袭, 并调节Snail、E-cadherin和claudin-1的表达^[25]。敲低P2X7受体后, ATP介导的体外迁移、侵袭以及对EMT相关基因表达的调节作用均被显著抑制。在P2X7受体低表达的22RV1前列腺癌细胞中过表达P2X7受体, ATP的促迁移、侵袭及其对Snail和E-cadherin表达的调节作用明显增强。使用LY294002和U0126分别抑制前列腺癌细胞中PI3K/AKT和ERK1/2信号通路的激活, ATP介导的体外迁移、侵袭以及对EMT相关基因表达的调节作用被显著抑制。敲低P2X7受体后, ATP对PI3K/AKT和ERK1/2信号通路的激活作用减弱。裸鼠体内实验的结果表明, 敲低P2X7受体能够明显抑制前列腺癌移植瘤的局部侵袭以及向肾、淋巴结的远处转移。此外, 敲低P2X7受体导致移植瘤组织中E-cadherin和claudin-1的表达上调、Snail的表达下调以及PI3K/AKT和ERK1/2信号通路的激活水平下降, 与体外实验结果相一致。以上结果表明, P2X7受体也是介导ATP促侵袭作用的重要受体。