引用本文
张永亮, 陈章健, 陈实, 卓琳, 贾光, 王云. 体外翻转肠囊法研究纳米二氧化钛对幼年大鼠小肠葡萄糖吸收的影响. 北京大学学报(医学版), 2017,49(3): 376-382.
ZHANG Yong-liang, CHEN Zhang-jian, CHEN Shi, ZHUO lin, JIA Guang, WANG Yun. Effect of nano-TiO2 on intestinal glucose absorption in young rat on the everted gut sac model . Journal of Peking University(Health Sciences), 2017,49(3): 376-382.  
Doi: 10.3969/j.issn.1671-167X.2017.03.002
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《北京大学学报（医学版）》编辑部
体外翻转肠囊法研究纳米二氧化钛对幼年大鼠小肠葡萄糖吸收的影响
张永亮, 陈章健, 陈实, 卓琳, 贾光, 王云
北京大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生学系, 北京 100191
收稿日期: 2017-01-12 网络出版时间:2017-4-28
基金资助: 国家自然科学基金青年基金项目(31400863)和北京市自然科学基金资助项目(7172116)资助
摘要

目的 探究纳米二氧化钛(TiO2)对幼年大鼠小肠葡萄糖吸收功能的影响及其尺寸效应。方法 取63只幼年(4周龄)雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠的小肠,建立63个体外翻转肠囊模型,研究葡萄糖浓度分别为10、25、50、100、200、400、800 mmol/L时,暴露于0、50 mg/L纳米TiO2(24 nm)2 h对小肠葡萄糖吸收功能的影响;并在此基础上,继续利用体外翻转肠囊模型,在400 mmol/L葡萄糖浓度下,研究暴露于0、10、50、200 mg/L纳米TiO2(24 nm)和微米TiO2(120 nm)2 h对小肠葡萄糖吸收功能的影响。每组3个肠囊。结果 幼年大鼠小肠的葡萄糖累积吸收量随葡萄糖浓度和染毒时间的增加而增加,仅在400 mmol/L葡萄糖浓度下,观察到50 mg/L纳米TiO2染毒组的葡萄糖累积吸收量和吸收速率在30 min( t累积吸收量=3.254, P<0.05; t吸收速率=3.958, P<0.05)、90 min( t累积吸收量=3.323, P<0.05; t吸收速率=3.063, P<0.05)、120 min( t累积吸收量=2.834, P<0.05; t吸收速率=3.002, P<0.05)时显著低于对照组。第二步研究中,与对照组相比,不同剂量纳米TiO2或微米TiO2染毒对幼年大鼠小肠葡萄糖的累积吸收量及乳酸累积生成量无明显影响。在相同染毒时间及染毒剂量下,未观察到纳米和微米TiO2染毒组组间葡萄糖累积吸收量及乳酸累积生成量的差异有统计学意义。结论 纳米TiO2短期暴露可能对幼年大鼠小肠葡萄糖吸收具有一定的抑制作用,且与微米TiO2的差异不明显。

关键词: 二氧化钛; 葡萄糖吸收; 翻转肠囊
中图分类号:R318.08 文献标志码:A 文章编号:1671-167X(2017)03-0376-07
Effect of nano-TiO2 on intestinal glucose absorption in young rat on the everted gut sac model
ZHANG Yong-liang, CHEN Zhang-jian, CHEN Shi, ZHUO lin, JIA Guang, WANG Yun
Department of Occupational and Environmental Health Science, Peking University School of Public Health, Beijing 100191, China
Fund:Supported by the National Natural Science Foundation of China (31400863) and the Beijing Natural Science Foundation (7172116)
Abstract

Objective: To study the effect of titanium dioxide (TiO2) nanoparticles on intestinal glucose absorption in young rats and its size effect.Methods: In the study, 63 small intestine segments were isolated from 63 Sprague-Dawley rats (SD rats, 4-week-old) to prepare the everted gut sac model. In the first part of our work, the everted sacs were exposed to 0, 50 mg/L TiO2 nanoparticles (24 nm) for 2 h with the presence of a series of glucose concentrations (10, 25, 50, 100, 200, 400, and 800 mmol/L), and the glucose absorbing function of the everted sacs were assessed in the process. On the basis of the work, utilizing the same method, further study was carried out to compare the effects of TiO2 nanoparticles (24 nm) and fine-particles (120 nm) on intestinal glucose absorbing function with the presence of 400 mmol/L glucose and 0, 10, 50, 200 mg/L TiO2. 3 intestine segments were used in each group.Results: The cumulative glucose absorption increased with time extension and increased glucose concentration. In the first part of our work, with the presence of 400 mmol/L glucose, the group treated with 50 mg/L TiO2 nanoparticles showed significantly lower cumulative glucose absorption and glucose absorbing rate than the control group at the exposure time of 30 min ( tcumulative absorption=3.254, P<0.05; tglucose absorbing rate=3.958, P<0.05), 90 min ( tcumulative absorption=3.323, P<0.05; tglucose absorbing rate=3.063, P<0.05) and 120 min ( tcumulative absorption=2.834, P<0.05; tglucose absorbing rate=3.002, P<0.05). At other glucose concentrations, statistically significant differences in cumulative glucose absorption or glucose absorbing rates were not found between the TiO2 nanoparticle exposed group and the control group. In the second part of our work, when compared with the control group, no significant downregulations in cumulative glucose absorption or glucose absorbing rates were observed in both TiO2 nano-particle treated group and TiO2 fine particle treated group. Differences between the TiO2 nanoparticle treated group and the TiO2 fine particle treated group were not statistically significant.Conclusion: Short-term exposure to TiO2 nanoparticles may downregulate the intestinal glucose absorbing function in young rats, and the difference with TiO2 fine particlesis is not obvious.

Key words: Titanium dioxide; Glucose absorption; Everted gut sac

二氧化钛(TiO2)是一种常用的食品添加剂, 被应用于我们日常生活中的各种食品, 包括糖果、奶酪、糖衣、焙烤食物、肉制品、鱼糜制品、调味料以及食品补充剂等。相比于常规TiO2, 粒径更小的纳米TiO2在改善食品口感、色泽上更具有优势, 因而得到了广泛的应用。经调查, 食品中的TiO2近36%颗粒处于纳米尺度, 且TiO2含量最高的食品为糖果、口香糖, 故喜食甜食的儿童成为纳米二氧化钛的高暴露人群[1]。

研究显示, 纳米TiO2对幼年大鼠的口服毒性作用较成年大鼠更为明显[2], 提示儿童可能是纳米TiO2的易感人群。已有研究发现, 即使低剂量的纳米TiO2暴露也可以引起肉鸡肠道组织形态的变化, 并对肉鸡铁元素的吸收造成一定的影响[3]。糖类为人体重要的营养素, 是维持机体生命活动的主要能源之一。糖类摄入不足会引起低血糖, 摄入过多则会引起肥胖、糖尿病等。有研究显示, 经口暴露TiO2可诱导动物血糖水平升高[4], 且纳米TiO2可与葡萄糖产生相互作用, 引起更强的毒性作用[5]。鉴于糖果类食品中TiO2含量最高, 葡萄糖是人体内糖的主要存在形式, 也是糖类在小肠内被吸收的主要形式之一, 故本研究旨在探索纳米TiO2对幼年大鼠肠道葡萄糖吸收的影响, 进一步揭示纳米TiO2的口服毒性, 以促进纳米TiO2在食品科学领域的安全有效应用。

1 材料与方法
1.1 主要仪器与试剂

透射电子显微镜(transmission electron microcopy, TEM, JEM-200CX)购自日本电子株式会社, 扫描电子显微镜(scanning electron microscopy, SEM, JSM-7401F)购自日本电子数据公司, X射线粉末衍射分析仪(X-ray powder diffractometry, XRD, X’ Pert PRO)购自荷兰PANalytical 公司, 全自动比表面和孔隙分析仪(ASAP 2020)购自美国Micromeritics公司, 葡萄糖氧化酶法测定试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司, 乳酸测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所, 纳米TiO2、微米TiO2购自上海晶纯实业有限公司, NaCl、MgSO4、葡萄糖、NaOH(分析纯)购自北京市通广精细化工公司, NaHCO3、HCl(分析纯)购自北京化工厂, KCl、CaCl2(分析纯)购自西陇化工股份有限公司, 乙二胺四乙酸四钠盐(Na4EDTA, 分析纯)购自天津市光复精细化工研究所, 实验用水为Milli-Q高纯水(电阻率18MΩ · cm)。

1.2 纳米TiO2与微米TiO2的表征

使用TEM和SEM表征所用纳米TiO2和微米TiO2的形貌与粒径大小, 使用XRD测量TiO2的晶型结构, 使用全自动比表面和孔隙分析仪测量TiO2的比表面积。

1.3 离体小肠翻转肠囊的制备

63只清洁级(CL)幼年(4周龄)雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠, 购买于北京大学医学部实验动物科学部[实验动物生产许可证:SCXK(京)2016-0010; 实验动物使用许可证:SYXK(京)2016-0041], 实验过程中研究人员严格遵守动物实验的各项伦理条例使用实验动物。大鼠禁食不禁水12 h后, 断髓处死, 沿腹中线剖开, 从胃幽门往下1 cm处开始往下取1段10 cm小肠。小心剥离肠表面的脂肪及肠系膜。用生理盐水冲洗至流出液不再浑浊且无肠内容物为止。洗净肠腔后, 肠段放于玻璃平皿内, 用Krebs-Henseleit 缓冲液(KHB液, NaHCO325 mmol/L; NaCl 118 mmol/L; KCl 4.7 mmol/L; MgSO4 1.2 mmol/L; NaH2PO4 1.2 mmol/L; CaCl2 1.2 mmol/L, Na4EDTA 9.7 mg/L, pH=7.4)[6, 7]洗1~2次。将小肠穿于特制带凹槽的玻璃棒上, 一端用丝线结扎于玻璃棒凹槽, 用指肚沿玻璃棒另一端翻转肠管。翻转小肠后, 肠囊另一端插入大鼠灌胃针并用丝线结扎, 往肠囊中注入1.5 mL KHB液, 将其移入已有37 ℃预热的KHB液的试管中平衡3 min, 过程中水浴保持37 ℃恒温, 并向试管中不断通入95%(体积分数)O2+5%(体积分数)CO2的混合气体。

1.4 体外翻转肠囊的染毒处理

1.4.1 不同葡萄糖浓度下纳米TiO2对小肠葡萄糖吸收的影响 分别将0、50 mg/L纳米TiO2和10、25、50、100、200、400、800 mmol/L葡萄糖加入KHB液中, 超声分散15 min, 制成14种不同的染毒液, 分别置于试管中, 37 ℃水浴锅中预热。42只SD大鼠随机分成14组, 每组3只, 每只大鼠分别取1段小肠制成离体小肠翻转肠囊。待离体肠囊于KHB液中平衡好后, 迅速将其置于盛有上述14种不同染毒液的试管中, 持续通入95%O2+5%CO2的混合气体, 开始计时。分别于10、20、30、60、90、120 min从肠囊浆膜侧取样, 每次取浆膜侧液体100 μ L, 并立即补充等量KHB液, 取出的样品置于EP管中, 并立即放入4 ℃冰箱中保存待测。

1.4.2 不同剂量纳米和微米TiO2对小肠葡萄糖吸收的影响 分别将0、10、50、200 mg/L纳米/微米TiO2和400 mmol/L葡萄糖加入KHB液中, 超声分散 15 min, 制成7种不同的染毒液, 分别置于试管中, 37 ℃水浴锅中预热。21只SD大鼠随机分成7组, 每组3只, 每只大鼠分别取1段小肠制成离体小肠翻转肠囊。待离体肠囊于KHB液中平衡好后, 迅速将其置于盛有上述不同染毒液的试管中, 持续通入95%O2+5%CO2的混合气体, 开始计时。分别于10、20、30、40、50、60 min从肠囊浆膜侧取样, 每次取浆膜侧液体100 μ L, 并立即补充等量KHB液, 取出的样品置于EP管中, 并立即放入4 ℃冰箱中保存待测。

1.5 葡萄糖和乳酸的测定

分别使用葡萄糖氧化酶法测定试剂盒和乳酸测定试剂盒测定不同时间点取样的浆膜侧液体中葡萄糖和乳酸的含量, 并按下面的公式计算0~t时间段内葡萄糖的累积吸收量Qt和平均吸收速率Vt, 以及0~t时间段内浆膜侧乳酸的累积生成量Qt和平均生成速率Vt。

D̅=(D0+D1)/2; L̅=(L0+L1)/2; S=π D̅ L̅,

Qt=V× Ct+Vs× ∑i=0t-1Ci; Vt=Qt/(t× S),

式中D0、D1分别为染毒前后肠囊中段直径, L0、L1分别为染毒前后肠囊长度, S为肠囊表面积, Ct为t时间时测得的浆膜侧葡萄糖或乳酸浓度, V为肠囊内液体体积, Vs为每次取样量。

1.6 统计学分析

采用SPSS 20.0软件分析。各剂量组的生物学指标数值经单样本K-S检验, 服从正态分布的数据以均数± 标准差(± s)表示。两组间比较采用t检验; 多组间比较采用方差齐性检验和单因素方差分析(one-way ANOVA), 方差齐时组间两两比较采用LSD-t检验, 方差不齐时组间两两比较采用Games-Howell检验, 以P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 材料表征

纳米TiO2和微米TiO2均为锐钛矿晶型, 近球形颗粒(图1)。纳米TiO2平均原始粒径为(24± 5)nm, 比表面积为79.84 m2/g; 微米TiO2平均原始粒径为(120± 30) nm, 比表面积为11.48 m2/g。

图1 纳米TiO2和微米TiO2的扫描电镜与透射电镜图Figure 1 SEM and TEM images of TiO2nanoparticles and TiO2 fine particles
A, B, SEM images of TiO2 nanoparticles and TiO2 fine particles respectively; C, D, TEM images of TiO2 nanoparticles and TiO2 fine particles respectively.

2.2 不同葡萄糖浓度下纳米TiO2对小肠葡萄糖吸收的影响

50 mg/L纳米TiO2染毒组与对照组的葡萄糖累积吸收量均随葡萄糖暴露浓度和暴露时间的增加而增加, 葡萄糖吸收速率随葡萄糖暴露浓度的增加而增加(图2A、B)。纳米TiO2染毒组的葡萄糖累积吸收量与吸收速率均略低于对照组, 且在400 mmol/L葡萄糖浓度下暴露30 min(t累积吸收量=3.254, P< 0.05; t吸收速率=3.958, P< 0.05)、90 min(t累积吸收量=3.323, P< 0.05; t吸收速率=3.063, P< 0.05)、120 min(t累积吸收量=2.834, P< 0.05; t吸收速率=3.002, P< 0.05)时观察到的差异有统计学意义(图2C)。

图2 不同葡萄糖浓度下纳米TiO2对幼年大鼠小肠葡萄糖吸收的影响Figure 2 Effect of TiO2 nanoparticles on intestinal glucose absorption with the presence of different glucose concentration in young rats
A, effects of TiO2 nanoparticles on intestinal cumulative glucose absorption in young rats with the presence of a series of glucose concentration; B, effects of TiO2 nanoparticles on intestinal glucose absorbing rate in young rats with the presence of a series of glucose concentration at 120 min; C, effects of TiO2 nanoparticles on intestinal glucose absorbing rate in young rats with the presence of 400 mmol/L glucose. mean ± SD, n =3. Significant dif-ference between TiO2 NPs exposure and control groups (* P< 0.05).

2.3 不同剂量纳米和微米TiO2对小肠葡萄糖吸收的影响

2.3.1 葡萄糖 400 mmol/L葡萄糖暴露浓度下, 如图3所示, 各组的葡萄糖累积吸收量随暴露时间的增加而增加, 平均吸收速率在40 min左右到达峰值。在同一暴露时间, 纳米TiO2各剂量组的葡萄糖累积吸收量与平均吸收速率均略低于对照组; 微米TiO2剂量组在10 mg/L与50 mg/L时葡萄糖累积吸收量与平均吸收速率略低于对照组, 200 mg/L剂量组略高于对照组, 但以上差异均无统计学意义(表1)。染毒相同的时间, 纳米TiO2或微米TiO2对葡萄糖累积吸收量及吸收速率的影响均未表现出明确的剂量-反应关系。在相同染毒时间和染毒剂量下, 均未观察到纳米和微米TiO2暴露组间葡萄糖累积吸收量及吸收速率的差异有统计学意义。

图3 不同剂量TiO2对幼年大鼠小肠葡萄糖吸收量和吸收速率的影响Figure 3 Effects of different concentration of TiO2 nanoparticles on intestinal cumulative glucose absorption and glucose absorbing rate in young rats
A, B, C, effects of 10, 50, 200 mg/L TiO2 nanoparticles on intestinal cumulative glucose absorption in young rats respectively; D, E, F, effects of 10, 50, 200 mg/L Tinanoparticles on intestinal glucose absorbing rate in young rats respectively. mean ± SD, n=3, the experiment was repeated three times.

2.3.2 乳酸 各组的乳酸生成量(图4A、B、C)均随暴露时间的增加而增加; 乳酸平均生成速率(图4 D、E、F)呈现出“ 降低-稳定-降低” 的趋势, 在20~40 min内保持相对稳定。纳米TiO2与微米TiO2暴露组的乳酸累积生成量与生成速率均略高于对照组, 但均未观测到明显差异(表2)。染毒相同的时间, 纳米TiO2及微米TiO2对累积乳酸生成量及生成速率的影响均未表现出明确的剂量-反应关系。同一暴露剂量同一暴露时间, 纳米TiO2暴露组的小肠乳酸累积生成量及生成速率与微米TiO2暴露组的亦无明显差异。

表1 400 mmol/L葡萄糖浓度下TiO2对葡萄糖吸收影响的单因素方差分析统计量 Table 1 One-way ANOVA results for glucose analysis when glucose concentration was 400 mmol/L

图4 不同剂量纳米TiO2对幼年大鼠小肠浆膜侧乳酸累积生成量和平均生成速率的影响Figure 4 Effects of different concentration of TiO2 nanoparticles on cumulative lactate generation and rate of lactate generation in serosal side of small intestine in young rats
A, B, C, effects of 10, 50, 200 mg/L TiO2nanoparticles on cumulative lactate generation in young rats respectively; D, E, F, effects of 10, 50, 200 mg/L TiO2 nanoparticles on rate of lactate generation in young rats respectively. mean ± SD, n=3, the experiment was repeated twice.

表2 400 mmol/L葡萄糖浓度下TiO2对乳酸生成影响的单因素方差分析统计量 Table 2 One-way ANOVA results for lactate generation when glucose concentration was 400 mmol/L
3 讨论

本研究首先在不同黏膜侧葡萄糖浓度下, 探究纳米TiO2暴露对幼年大鼠小肠葡萄糖吸收功能的影响, 然后选择在400 mmol/L黏膜侧葡萄糖浓度下, 探究了不同浓度及不同尺寸TiO2颗粒染毒对幼年大鼠小肠葡萄糖吸收功能的影响。结果发现, 纳米TiO2(24 nm)与微米TiO2(120 nm)对幼年大鼠小肠葡萄糖吸收有轻微的抑制作用, 且能促进小肠乳酸生成, 但与对照组相比, 差异无统计学意义, 且纳米TiO2与微米TiO2暴露组之间的差异亦无统计学意义。

葡萄糖是人体内存在的主要碳水化合物之一, 其吸收、转运主要发生在小肠上段。肠道对葡萄糖的吸收主要有两条途径, 即通过肠黏膜上Na+依赖性葡萄糖转运蛋白1介导的主动转运吸收, 以及肠腔中高浓度葡萄糖时的易化扩散两种途径。小肠黏膜存在很多环形皱襞、绒毛和微绒毛, 这些结构可以大大增加小肠的吸收表面积, 进而提高小肠的吸收功能。当皱襞、绒毛、微绒毛等结构退化或受到破坏时, 将大大降低小肠的吸收表面积, 降低小肠的吸收能力。Faust等[8]的研究显示, 即使暴露于低剂量的TiO2, 肠黏膜刷状缘的结构也会发生改变, 食品级TiO2暴露后会引起肠黏膜近42%微绒毛的损失, 将大大降低肠道对营养物质的吸收能力。同时, 有研究发现, 纳米TiO2暴露可降低肠上皮细胞的活性[9]。Setyawati等[10]的研究发现, 3种肠上皮细胞(NCM460、SW480、TR146)暴露于纳米TiO2后, 细胞内氧化应激水平升高, 并不同程度地滞留于有丝分裂G2/M期, 进而发生有丝分裂障碍, 最终引起细胞凋亡.小肠是体内自我更新最旺盛的组织之一, 可以通过自我更新维持正常的生理功能。纳米TiO2对肠上皮细胞的毒性作用可能会引起小肠生理功能的异常, 影响小肠葡萄糖的吸收。纳米TiO2暴露还可引起辅助性T细胞-1介导的炎症反应, 使空肠内的CD4+细胞、白细胞介素-4(IL-4)、IL-12、IL-23、肿瘤坏死因子-α 、干扰素-γ 和转化生长因子-β 等炎性因子在肠道内的表达生成水平升高[11], 另有研究发现, TiO2暴露可能会引起克罗恩病(Crohn disease)[12], 这些炎症反应不仅会增加细胞耗能、增加葡萄糖的消耗、使浆膜侧的乳酸含量增高, 还可以提示肠道结构功能的损伤, 影响葡萄糖的主动运输和易化扩散。

有关纳米TiO2的尺寸效应研究, 目前结果尚不一致。Renwick[13]研究发现, 粒径小的纳米TiO2颗粒暴露24 h能引起更严重肺部炎症反应。但Kim等[14]研究发现, 不同粒径的纳米颗粒暴露后1周, 在肺部引起的炎症反应没有差异。Nogueira等[11]的经口染毒研究发现, 纳米TiO2(66 nm)处理组和微米TiO2(260 nm)处理组在小鼠小肠引起的炎症反应没有明显差异。本研究比较了纳米TiO2和微米TiO2对小肠葡萄糖吸收的影响, 结果显示纳米TiO2暴露组的小肠葡萄糖累积吸收量及乳酸累积生成量和微米TiO2暴露组无明显差别。纳米TiO2的尺寸效应可能与研究所用的组织细胞、材料粒径大小、聚合程度、观测时间等有一定关系。考虑到本研究只设计了2个粒径的TiO2, 纳米TiO2的尺寸效应尚不足以排除, 仍有待进一步研究。

本研究在探讨不同葡萄糖浓度下纳米TiO2对小肠葡萄糖吸收的影响时, 观察到在400 mmol/L葡萄糖浓度下, 纳米TiO2染毒可显著降低幼年大鼠小肠葡萄糖累积吸收量及吸收速率。但在随后研究不同剂量纳米和微米TiO2对小肠葡萄糖吸收的影响时, 却未观察到显著差异, 考虑此部分研究结果的标准差较大是造成差异无统计学意义的原因之一, 我们再次重复了实验, 控制了实验测试条件, 但仍然得到相同的结果。标准差较大可能与动物个体差异因素直接相关。不同动物个体对葡萄糖吸收的能力水平可能存在差异; 另外葡萄糖是生命活动的主要能源物质, 肠囊实验过程中小肠吸收转运葡萄糖的同时亦会消耗部分葡萄糖, 不同动物的个体代谢水平是否会影响葡萄糖吸收结果也值得考虑。本实验测定了乳酸的含量, 可反映一部分葡萄糖的代谢情况, 但仍可能存在其他葡萄糖代谢途径。此外, 体外翻转肠囊模型存在着小肠组织功能只能维持2 h的局限性[15], 因此本研究中纳米TiO2的暴露时间也局限于2 h内, 可能不足以显著影响肠道的葡萄糖吸收功能。但鉴于体外翻转肠囊模型是一种体外研究药物转运和营养素吸收的经济、高效、稳定的实验方法[15], 今后有必要去探求如何改进研究设计, 以更好地使用该模型研究纳米TiO2对葡萄糖吸收的影响, 如分组实验尽量控制动物个体差异, 并考虑将动物进行较长期在体暴露实验后, 再取小肠进行体外翻转肠囊实验。

综上, 短期暴露纳米TiO2可能会抑制幼年大鼠小肠对葡萄糖的吸收, 且未表现出与微米TiO2显著不同的生物学效应。考虑到本研究的TiO2暴露时间仅有2 h, 而人体经食品接触纳米TiO2具有长期低剂量的特点, 有研究显示纳米TiO2的口服毒性作用表现出随着染毒时间的延长逐渐增加的现象, 提示我们应考虑在亚慢性、慢性染毒情况下, 进一步探讨纳米二氧化钛对营养素吸收的影响。

The authors have declared that no competing interests exist.

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