引用本文
蔡源发, 张华明, 钮文异, 邹永秋, 马德福. 雌马酚对大肠癌细胞增殖的影响. 北京大学学报(医学版), 2017,49(3): 383-387.
CAI Yuan-fa, ZHANG Hua-ming, NIU Wen-yi, ZOU Yong-qiu, MA De-fu. Effects of equol on colon cancer cell proliferation. Journal of Peking University(Health Sciences), 2017,49(3): 383-387.  
Doi: 10.3969/j.issn.1671-167X.2017.03.003
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《北京大学学报（医学版）》编辑部
雌马酚对大肠癌细胞增殖的影响
蔡源发, 张华明, 钮文异, 邹永秋, 马德福
北京大学公共卫生学院社会医学与健康教育系, 北京 100191
收稿日期: 2017-02-28
基金资助: 国家自然科学基金(81202193,81573130)、北京市自然科学基金(7122103,7172117)资助
摘要

目的 检测大豆异黄酮代谢产物雌马酚对大肠癌细胞增殖的影响,并探讨其分子作用机制。方法 培养大肠癌细胞 DLD1、HCT15、COLO205、LOVO和SW480,用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]法检测雌马酚对大肠癌细胞增殖的影响,用逆转录PCR和蛋白免疫印迹法分别检测雌激素受体和核因子红系2相关因子2[nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2,Nrf2]表达状况。用MTT法检测雌激素受体抑制剂和激动剂对大肠癌细胞增殖的影响。结果 DLD1、HCT15、COLO205、LOVO和SW480均表达雌激素受体(estrogen receptor, ER)β,但只有DLD1和HCT15有ERα弱表达。MTT试验显示不同剂量雌马酚(0、0.5、1、5、10 μmol/L)不仅能够显著抑制ERα和ERβ均表达的大肠癌细胞HCT-15的增生,且呈现明显的剂量效应关系,而且能够抑制只有ERβ表达的大肠癌细胞LOVO和SW480的增生,且呈现明显的剂量效应关系。此外,逆转录PCR发现不同剂量雌马酚刺激后,HCT-15的雌激素受体ERα和ERβ表达明显增加,呈剂量效应关系。蛋白免疫印迹法进一步证实雌激素受体ERα和ERβ蛋白表达随雌马酚剂量的增加而增加,蛋白免疫印迹法发现Nrf2随干预剂量的增加而表达明显增加。采用ERβ激动剂、雌激素受体抑制剂和特异性雌激素受体ERα激动剂对SW480、LOVO、HCT-15细胞刺激后,只发现不同剂量ERβ激动剂能够显著抑制大肠癌细胞SW480、LOVO、HCT-15的增生,且呈明显的剂量效应关系,但是,雌激素受体抑制剂和特异性雌激素受体ERα激动剂对SW480、LOVO和HCT-15细胞没有呈现显著的影响。结论 雌马酚能够通过雌激素样作用和抗氧化活性抑制大肠癌细胞的增殖。

关键词: 雌马酚; 大肠癌; 雌激素受体; 增殖
中图分类号:R393 文献标志码:A 文章编号:1671-167X(2017)03-0383-05
Effects of equol on colon cancer cell proliferation
CAI Yuan-fa, ZHANG Hua-ming, NIU Wen-yi, ZOU Yong-qiu, MA De-fu
Department of Social Medicine and Health Education, Peking University School of Public Health, Beijing 100191, China
△ Corresponding author’s e-mail, madefu@bjmu.edu.cn
Fund:Supported by the National Natural Science Foundation of China (81202193,81573130) and the Beijing Natural Science Foundation(7122103,7172117)
Abstract

Objective: To investigate the effect of equol on the proliferation of colom cancer cells and to explore the mechanisms.Methods: Colon cancer cells (DLD1,HCT15,COLO205,LOVO,SW480) were incubated, the cell proliferation was identified by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide cell proliferation assay. Reverse transcription PCR and Western blot were used to measure the mRNA and the protein expression of estrogen receptor and nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (Nrf2)in the colon cancer cells, respectively. Moreover, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide cell proliferation assay was used to investigate the effect of estrogen receptor(ER) inhibitor,ERα agonist, and estrogen receptor ERβagonist on the cell proliferation.Results: ERα was faintly expressed in the DLD-1 and HCT-15 cells. However, ERβ expression in DLD1, HCT15, COLO205, LOVO, and SW480 colon cancer cells. Different concentrations of equol (0, 0.5, 1, 5, 10 μmol/L) significantly inhibited the growth of HCT-15 cell with the expression of ERα and ERβ.More-over, different concentrations of equol (0, 0.5, 1, 5, 10 μmol/L) significantly inhibited the growth of LOVO, and SW480 cells with the ERβ expression in a dose-dependent manner as demonstrated with a 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide cell proliferation assay. mRNA expressions of ERα and ERβ in HCT-15 were stimulated significantly. Western blotting proved that the protein expressions of ERα and ERβ increased with the increasing of equol dose. Moreover we found significant difference of Nrf2 protein expression in HCT-15 cell stimulated by different concentrationss of equol. After the similation of estrogen receptor inhibitor, ERα agonist, or ERβ agonist, we found that only dif-ferent concentrations of ERβ agonist(0, 1, 10, 100, 1 000, 10 000 nmol/L) significantly inhibited the growth of HCT-15, LOVO, and SW480 in adose-dependent manner. Estrogen receptor inhibitor and ERα agonistdid not present significant effect on the cell proliferation of HCT-15, LOVO, and SW480.Conclusion: Equol inhibited the colon cancer cell proliferation by its estrogenic activities and antioxidant activities.

Key words: Equol; Colon cancer; Estrogen receptor; Proliferation

大肠癌是西方国家第二位高发恶性肿瘤, 且发病率和死亡率均有逐年上升的趋势, 饮食习惯与饮食结构改变等可能是大肠癌高发的重要诱因。据国际癌症研究组织(International Agency for Research on Cancer, IARC)提供的数据显示, 亚洲地区、尤其是经济发达地区, 由于生活方式的转变(低脂和植物蛋白为主的饮食向高脂和动物蛋白为主的饮食转变), 其大肠癌的发病率迅速增长, 已经接近西方国家, 如目前日本男性年龄标化发病率已经达到49.3/10万人, 中国香港男性达到了60/10万人[1], 因此, 研究预防和治疗大肠癌的新的有效方法成为目前我国医学研究邻域的重中之重。

大豆异黄酮结构与雌激素相似, 表现出弱的雌激素活性(大约是雌二醇的1/100~1/1 000)及抗雌激素活性[2]。目前国内外开发了大量的大豆异黄酮产品, 用于改善妇女更年期症状, 预防骨质疏松和心血管疾病[3]。雌马酚是大豆异黄酮在体内通过生物转化产生的具有较稳定化学结构的最终代谢产物, 雌马酚是大豆异黄酮及其代谢产物中雌激素样活性最高的一种。虽然大豆异黄酮的雌激素样作用对预防和治疗大肠癌发生的有效性已经被证实, 但大豆异黄酮代谢产物雌马酚对非雌激素依赖性大肠癌的影响还不清楚, 因此, 本研究将通过细胞试验观察大豆异黄酮的代谢产物雌马酚对大肠癌细胞增殖的影响, 并探讨其相关分子作用机制。

1 资料与方法
1.1 材料和试剂

雌马酚购于美国LC Laboratories 公司, 雌激素受体[estrogen receptor, ERα (SC-542)]、ERβ (SC-8974)、β -actin (SC-47778)和核因子红系2相关因子2[nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2, Nrf2]抗体购自美国Santa Cruz Biotecnology公司, 二抗抗体购自爱尔兰Rockland 公司, RNA提取用Trizol试剂、cDNA合成试剂盒、胎牛血清、细胞培养基购于美国Invitrogen公司, PCR试剂盒购于美国Applied Biosystems, Branchburg公司, 蛋白提取、定量及蛋白免疫印迹相关材料试剂购自美国Bio-rad公司, 3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide, MTT]试剂购于美国Sigma公司, 雌激素受体(estrogen receptor, ER)抑制剂(ICI182780)、ERα 激动剂[1, 3, 5-tris(4-hydroxyphenyl)-4-propyl-1H-pyrazole, PPT]和ERβ 激动剂(diarylpropionitrile, DPN)购于美国Sigma公司。

1.2 细胞培养

人大肠癌细胞DLD1、HCT15、COLO205、LOVO、和SW480购自北京协和医学院基础医学细胞中心, 用含10%(体积分数)胎牛血清的1640培养基, 在5% CO2(体积分数)、37 ℃培养箱中培养。

1.3 逆转录PCR及引物

按照Trizol说明书提取总RNA, 浓度和纯度检测用紫外分光光度仪(ND-1000, NanoDrop Techno-logies 公司, 美国)。ERα , ERβ 和GAPDH的特异性引物序列如下:GAPDH, 上游引物:5'-GATGACATCAAGAAGGTGGTGA-3', 下游引物: 3'-TTCGTTGTCATACCAGGAAATG-5'; ERα , 上游引物: 5'-AGAGAAAGATTGGCCAGTACCA-3', 下游引物: 3'-TCCTCTTCGGTCTTTTCGTATC-5'; ERβ , 上游引物: 5'-GTCTGGTCGTGTGAAGGATGTA-3', 下游引物: 3'-ACCATTCCCACTTCGTAACACT-5'。

1.4 蛋白免疫印迹

用聚氰基丙烯酸正丁酯(butyleyanoacrylate, BCA)蛋白浓度测定法进行定量。50 μ g总蛋白等量上样, 10%(质量分数)的聚丙稀铣胺凝胶电泳分离蛋白, 湿法转至聚偏氟乙烯膜。5%(质量分数)脱脂奶室温封闭2 h后, ERα 、ERβ 、Nrf2和β -actin的一抗抗体用5%脱脂奶1 :200稀释, 4 ℃孵育过夜。用TBST缓冲液(tris buffered saline, with tween-20, pH8.0)漂洗3次后加入二抗, 室温下孵育1 h, 使用增强荧光发光试剂显影, 然后使用图像成像系统检测条带。

1.5 细胞增殖检测

细胞以100 μ L/孔(2× 103个细胞)接种于96孔板, 约24 h后换成含雌马酚的新鲜培养基。雌马酚浓度分别为0、0.5、1、5、10 μ mol/L。过夜培养后, 每孔加入10 μ L MTT测定细胞浓度, 采用酶联免疫检测仪(Thermo公司, 美国)在570 nm和650 nm波长处测定其光密度值。每次试验连续测4 d。

1.6 ER抑制剂和激动剂对细胞增殖的影响

细胞以100 μ L/孔(2× 103个细胞)接种于96孔板, 约24 h后, 换成含二甲基亚砜、ER抑制剂(ICI182780)、ERα 激动剂 (PPT)或ERβ 激动剂 (DPN)的新鲜培养基。试剂浓度分别为0、1、10、100、1 000、10 000 nmol/L, 过夜培养后, 每孔加入10 μ L MTT测定细胞浓度, 采用酶联免疫检测仪(Thermo公司, 美国)在570 nm和650 nm波长处测定其光密度值。每次试验连续测4 d。

1.7 雌马酚抑制大肠癌细胞增殖的作用机制

采用不同剂量的雌马酚(0、0.5、1、5、10 μ mol/L)对人大肠癌细胞HCT-15刺激, 然后采用逆转录PCR检测了雌激素受体核糖体mRNA表达状况, 并采用Western blot检测雌激素受体和Nrf2的蛋白表达状况。

1.8 统计学分析

用SPSS 13.0统计软件进行分析, 计量资料用± s描述, 多组间比较用方差分析, 进一步两两比较采用SNK检验, 显著性水准为α =0.05。

2 结果
2.1 大肠癌细胞雌激素受体表达状况

采用逆转录PCR和Western blot发现不同的大肠癌细胞雌激素受体表达状况不同。逆转录PCR结果显示DLD1、HCT15、COLO205、LOVO和SW480均表达ERβ , 但只有DLD1和HCT15有ERα 弱表达(图1), Western blot进一步证实了此结果, 显示在蛋白水平上雌激素受体ERβ 在DLD1、HCT15、COLO205、LOVO和SW480上均有表达, 而ERα 仅在DLD1和HCT15上呈现弱表达(图2)。

图1 大肠癌细胞雌激素受体mRNA表达状况Figure 1 Estrogen receptor mRNA expression profile in the colon cancer cells
1, SW480; 2, DLD-1; 3, COLO205; 4, HCT-15; 5, LOVO; ER, estrogen receptor.

图2 大肠癌细胞雌激素受体蛋白表达状况Figure 2 Estrogen receptor protein expressionprofile in the colon cancer cells
1, SW480; 2, DLD-1; 3, COLO205; 4, HCT-15; 5, LOVO; ER, estrogen receptor.

2.2 雌马酚对大肠癌细胞HCT-15、LOVO和SW480增殖的抑制作用

HCT-15、LOVO和SW480按2 000个细胞/孔接种在96孔板, 24 h后换新鲜培养基, 按设计的药物浓度给药, 雌马酚的浓度分别为0、0.5、1、5、10 μ mol/L。MTT法连续测定4 d后结果显示, 不同浓度的雌马酚不仅能够显著抑制ERα 和ERβ 均表达的大肠癌细胞HCT-15的增殖, 也能显著抑制只有ERβ 表达的大肠癌细胞LOVO和SW480的增殖, 且呈明显的剂量效应关系(图3)。

图3 不同剂量的雌马酚抑制HCT-15、LOVO和SW480细胞增殖Figure 3 Differential concentration of equol inhibited cell proliferation of HCT-15, LOVO, and SW480 cell lines
A, HCT-15 cell; B, LOVO cell; C, SW480 cell.

2.3 雌马酚抑制大肠癌细胞的增殖

逆转录PCR结果显示, 不同剂量的雌马酚(0、0.5、1、5、10 μ mol/L)刺激大肠癌细胞HCT-15持续8 h后, ERα 和ERβ 的核糖体mRNA水平明显增加(图4), Western blot进一步证实了此结果(图5)。

进一步采用Western blot检测Nrf2的表达, 发现不同剂量的雌马酚(0、0.5、1、5、10 μ mol/L)刺激大肠癌细胞HCT-15持续12 h后, Nrf2的蛋白表达水平随雌马酚剂量的增加而明显增加(图6)。

图4 不同剂量雌马酚刺激后大肠癌细胞HCT-15的雌激素受体mRNA表达状况Figure 4 Estrogen receptor mRNA expression profile in the HCT-15 cell stimulated by different concentration of equol
ER, estrogen receptor.

图5 不同剂量的雌马酚刺激后大肠癌细胞HCT-15的雌激素受体蛋白表达状况Figure 5 Estrogen receptor protein expression profile in the HCT-15 cell stimulated by different concentration of equol
ER, estrogen receptor.

图6 不同剂量雌马酚刺激后大肠癌细胞HCT-15的Nrf2蛋白表达状况Figure 6 Nrf2 protein expression profile in the HCT-15 cell stimulated by different concentration of equol
Nrf2, nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2.

2.4 ER抑制剂和激动剂对大肠癌细胞HCT-15、LOVO和SW480增殖的抑制作用

选择SW480、LOVO、HCT-15细胞为代表性细胞, 采用ERβ 激动剂(DPN), ER抑制剂(ICI182780)和特异性ERα 激动剂(PPT)对SW480、LOVO、HCT-15细胞进行刺激。如图7所示, 不同剂量ERβ 激动剂能够显著抑制大肠癌细胞SW480、LOVO、HCT-15的增生, 且呈明显的剂量效应关系, 但是, ER抑制剂(ICI182780)和特异性ERα 激动剂(PPT)对SW480、LOVO和HCT-15细胞实施刺激, 没有发现显著的剂量效应关系。

图7 不同剂量的ERβ 受体激动剂(DPN)显著抑制大肠癌细胞SW480、LOVO、HCT-15的增生Figure 7 Differential concentration of ERβ agonist inhibited cell proliferation of SW480, LOVO, and HCT-15 cell lines
A, HCT-15 cell; B, LOVO cell; C, SW480 cell.

3 讨论

我国随着生活水平提高, 饮食习惯改变, 大肠癌总体发病率一直呈上升趋势, 据调查2000年至2005年间发病人数增加12万, 男性增加19.1%, 女性增加17.7%, 由原来占恶性肿瘤的第7位上升至第3位。大肠癌的发生是一个多因素、多步骤的过程, 是机体内因与环境的外因相互作用的结果。目前多数学者提出, 只有根据大肠癌发病因素采取相应的预防和治疗措施, 才能降低大肠癌的发病率[1]。

大豆异黄酮的主要成分包括金雀异黄素、大豆素和黄豆黄素, 在大豆及其制品中含量较高, 为人类主要植物雌激素来源。大豆异黄酮的雌激素活性常被用于改善妇女更年期症状, 预防骨质疏松、心血管疾病和激素依赖性肿瘤(如乳腺癌, 前列腺癌)的发生[4]。最近, 一篇Meta分析显示, 大豆异黄酮摄入能够显著降低女性大肠癌的发病风险(RR=0.79, 95% CI 0.65-0.97, P=0.026)[5]。一些实验研究也已证实, 金雀异黄素能够活化ERβ , 阻碍酪氨酸蛋白激酶的表达, 继而抑制大肠癌细胞的增生[6], 此外, 金雀异黄素还能诱导癌细胞的凋亡和抑制血管生成[6]。Raju等[7]报告说大豆异黄酮能够抑制氧化偶氮甲烷诱导的大鼠大肠癌发生和通过增加ERβ 表达抑制大肠癌细胞DLD-1的增生。

雌马酚与ER的亲和力接近17β -雌二醇, 与金雀异黄素大致相当, 但诱发转录的能力比金雀异黄素高得多, 是异黄酮衍生物中最高的[8]。我们以前的研究已经证明雌马酚对雌激素依赖性肿瘤如乳腺癌和前列腺癌等有显著的抑制生长作用, 能够显著抑制雌激素依赖性乳腺癌细胞MCF-7和前列腺癌细胞DU145的增生, 且其抗癌活性显著强于金雀异黄素和大豆素[9]。此外, 我们实施的雌马酚对二甲基苯蒽诱导的去势大鼠乳腺肿瘤的研究发现, 雌马酚能够显著降低去势大鼠的乳腺肿瘤发生率[10, 11]。人雌激素受体ERα 和ERβ 两种亚型的DNA结合区氨基酸系列同源性达95%, 配体结合区氨基酸系列同源性为55%, 两者在结构上的相似性决定了他们在功能上的相似性, 但这两种受体结合的配体并不完全相同。研究发现ERα 比ERβ 在激活基因转录上作用显著, 而ERβ 在抑制基因转录上比ERα 强, 因此推测ERα 主要是作为基因转录的激动剂, 而ERβ 主要是作为基因转录的抑制剂发挥作用[12]。本研究则证实雌马酚可以通过增加雌激素受体ERα 和ERβ 的表达抑制大肠癌细胞的增殖。除此之外, 本研究发现雌马酚刺激大肠癌细胞后, Nrf2蛋白表达明显增加。Nrf2是抗氧化效应的关键因子, 研究已经证实Nrf2可以通过Nrf2-ARE通路调节超氧化物歧化酶的活性[13]。本研究结果提示, 雌马酚的抗氧化活性在大肠癌细胞的增殖抑制过程中也发挥重要的作用。

总之, 雌马酚能够通过刺激雌激素受体的表达显著抑制大肠癌细胞增殖, 此外, 雌马酚的抗氧化活性也发挥一定的抑制癌细胞增殖作用。本研究结果将为大豆异黄酮及其代谢产物雌马酚的有效利用提供科学依据。

The authors have declared that no competing interests exist.

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