人胃癌细胞株AGS、BCG823、MNK45和PHM82由北京大学基础医学院病原生物学系实验室提供。胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)购自美国Gibco公司, RPMI-1640培养基购自美国Hyclone公司。GenStar PCR 2× Mix购自北京全式金生物技术有限公司, 快速PCR扩增的热启动高保真DNA聚合酶试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司, 琼脂糖粉购自美国Invitrogen公司, Lipofextamine 2000购自美国Invitrogen公司。

胃癌细胞系AGS、BCG823、PHM82、MNK45分别培养于含10%(体积分数)灭活FBS的RPMI-1640培养液中, 在37 ℃、5%(体积分数)CO₂条件下培养, 每3天换一次液, 当细胞达到90%融合度时用消化液(0.25%胰酶和0.01%EDTA, 均为体积分数)消化, 按1 :3传代。

用实时PCR(real-time PCR, RT-PCR)选择CapG表达低的细胞。分别培养上述步骤中的胃癌细胞系(AGS、BCG823、PHM82、MNK45), 用Trizol法提取细胞系总RNA, 用RevertAid第1链cDNA合成试剂盒合成cDNA, 并以此为模板进行RT-PCR, 检测4种胃癌细胞系的CapG表达水平。CapG引物和内参基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)的引物序列参照文献[1]:CapG引物序列为F:5'-CCC AGA GTG GCT CTC CAT TC-3', R:5'-GAA GAC GCC CTG GTT CTC TTG-3'; 内参基因GAPDH的引物序列为F:5'-GAA GGT GAA GGT CGG AGT TC-3', R:5'-CAT GGG TGG AAT CAT ATT GGA A-3', 均由上海生工公司合成。RT-PCR用25 mL的体系:SYBR Green RT-PCR Master Mix(Toyobo)12.5 mL, 上、下游引物各1 mL(10 mmol/L), cDNA 1 mL, 焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate, DEPC)水补至25 mL。反应参数:95 ℃预变性10 min, 95 ℃变性30 s, 57 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 35 个循环; 熔解曲线50 ℃ 1 s, 95 ℃持续, 每摄氏度取15个点; 40 ℃降温, 得出各个胃癌细胞系CapG的相对表达量, 比较 AGS、BCG823、PHM82、MNK45胃癌细胞系CapG的表达水平。所有实验重复3次。

1.4.1 pLEX-Myc-eGFP(增强绿色荧光蛋白, enhanced green fluorescent protein)-CapG表达质粒的构建 设计可扩增CapG全长编码序列的特异性引物, 以HeLa细胞的cDNA为模板, 利用高保真酶PCR进行PCR扩增, 得到CapG编码序列加上Flag标签的目的片段。将PCR产物进行纯化回收, 将其连接至pLEX-Myc-eGFP载体, 对pLEX-Myc-eGFP-CapG表达质粒进行测序, 将pLEX-Myc-eGFP-CapG表达质粒瞬时转染HeLa细胞, Western blot实验验证。

1.4.2 pLEX-Myc-CapG病毒上清制备 将对数生长期的293T细胞接种至10 cm培养皿, 密度为70%左右。24 h后培养皿内更换为不含抗生素的DMEM培养基, 用lipo2000转染质粒pLEX-Myc-CapG+p8.74+VSVG(水疱性口炎病毒, vesicular stomatitis virus G), 质量比为5.0 :3.5 :1.5, 对照组用pLEX-eGFP质粒; 48 h后更换新鲜的完全培养基; 96 h后取上清, 3 000 r/min离心10 min, 用0.45 mmol/L滤膜过滤, 分装, 冻存于-80 ℃备用, 同时用Western blot实验验证CapG表达情况。

1.4.3 CapG慢病毒表达胃癌细胞系的构建 将AGS细胞铺于六孔板内, 细胞密度为30%左右, 24 h后加入含有10 mg/L聚凝胺(polybrene)的CapG病毒上清2 mL, 48 h后更换完全培养基, 72 h后加入筛选药物嘌呤霉素(puromycin), 持续筛选 5 d后, 荧光显微镜下观察荧光细胞所占比例, Western blot实验验证表达情况。

收集对数期生长的CapG过表达胃癌细胞系AGS及对照细胞, 以每孔3× 10³/200 mL接种在96孔板中, 每组细胞设置5个复孔, 共铺5板, 每板细胞周边加一圈磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline, PBS)或培养基, 在5%CO₂、37 ℃培养温箱内培养, 每隔24 h检测1次。

在6孔板每孔的底面用记号笔对称画3条线, 间隔0.5~1.0 cm左右。培养生长状态良好的AGS稳定转染细胞系, 接种至预先画好标记线的6孔板内, 每孔接种约2× 10⁶个细胞(过夜培养细胞贴壁后汇合率达95%以上)。第2天用无菌10 mL枪头在每孔中央划一条直线, 枪头要垂直, 用力需均匀。随后, 用PBS轻柔操作, 清洗细胞表面, 去掉脱落的细胞及细胞碎片, 孔内更换为无血清培养基, 放入培养箱内。2 h后在倒置显微镜下观察细胞划痕情况并拍照, 然后放入细胞培养箱内继续培养。在随后的12 h、24 h、36 h和48 h时间点分别拍照记录, 拍照前若有悬浮死细胞, 则用PBS清洗换液后再进行拍照。最后用Image J软件测量细胞划痕间的宽度, 定量比较细胞迁移的速度。

实验前24 h将处于对数生长期的实验组及对照组细胞的培养基更换为无血清培养基。

1.7.1 小室制备 在24孔板内加入800 mL含10%(体积分数)血清的完全培养基, 将小室轻轻放入24孔板内, 使小室下层浸润于液面下, 避免液面与小室下层之间产生气泡。

1.7.2 细胞准备 胰酶消化细胞, PBS洗两遍, 计数, 取0.5× 10⁴~1× 10⁴个细胞, 1 200 r/min离心5 min, 弃上清, 加入150 mL不含血清的培养基重悬细胞, 然后移入Transwell小室内轻轻混匀。

1.7.3 固定、染色 培养48 h后用棉签擦去小室上部未穿膜的细胞, 在24孔板内加入800 mL 4%(体积分数)多聚甲醛室温固定 20~30 min, PBS洗2次, 然后加入0.1%(体积分数)结晶紫染液室温染色30 min, PBS洗2次。

1.7.4 镜下观察 在倒置显微镜下观察并拍照, 计算穿过小室膜的细胞数。

本研究所有的统计学分析均采用SAS 9.1软件实现。CCK8实验和Transwell实验均采用配对t检验, P< 0.05为差异有统计学意义。

RT-PCR检测结果如图1所示, CapG基因在4种胃癌细胞系中均有表达, 其中在BCG823细胞中表达水平最高, 在AGS表达水平最低。因此, 在后续实验中选择AGS细胞作为过表达CapG基因功能研究的细胞株。

图1

Figure 1

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图1 胃癌细胞系中CapG基因的表达检测Figure 1 Detection of CapG gene expression in gastric cancer cell lines

本实验目的片段CapG编码序列加上Flag标签的理论值为1 070 bp, 而PCR扩增产物经电泳后可见约1 000 bp的条带, 3个条带均为加上Flag标签后的目的片段CapG(图2A), 与理论值相符合, 质粒经酶切、连接、转化后得到白色单克隆菌(图2B), 测序结果证实, pLEX-Myc-eGFP-CapG表达质粒序列正确。将pLEX-Myc-eGFP-CapG表达质粒瞬时转染HeLa细胞, Western blot实验证实pLEX-Myc-eGFP-CapG表达质粒可以成功表达带有Flag标签的CapG蛋白(图2C)。

图2

Figure 2

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图2 pLEX-Myc-eGFP-CapG表达质粒的构建Figure 2 Construction of pLEX-Myc-EGFP-CapG’ s expressed plasmid A, CapG bands was obtained by agarose gel electrophoresis; B, the plasmid’ s sequencing result picture; C, Western blot was used to verify CapG expression. CapG, macrophage-capping protein; eGFP, enhanced green fluorescent protein.

用含有pLEX-Myc-CapG的病毒上清侵染293T细胞后, 经Western blot实验验证293T细胞中瞬时表达CapG的情况, 结果如图3所示, CapG慢病毒表达系统构建成功, 病毒侵染293T细胞后可在293T细胞中成功表达CapG蛋白。为构建稳定表达外源CapG的胃癌细胞系, 用CapG病毒液侵染AGS细胞, 72 h后加入筛选药物嘌呤霉素, 持续筛选7 d后, 在荧光显微镜下观察eGFP病毒液的侵染效果, 荧光细胞所占比例约为80%(图4), 侵染效果良好。Western blot实验检测细胞表达外源CapG的情况, 用外源CapG蛋白的标签抗体能够在AGS细胞中清楚检测到外源CapG蛋白结果(图5), 可证实过表达外源CapG的稳定转移胃癌细胞系构建成功。

图3

Figure 3

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图3 Western blot 验证瞬时表达CapG的293T细胞Figure 3 Western blot verified transient expression of CapG in 293T cells Abbreviations as in Figure 2.

图4

Figure 4

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图4 荧光显微镜下观察慢病毒的侵染效果 (× 100)Figure 4 The effect of lentivivus was observed under fluorescence microscopy (× 100)

图5

Figure 5

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图5 Western blot 验证稳定表达CapG的AGS细胞Figure 5 Western blot verified the stable expression of CapG in AGS cells Abbreviations as in Figure 2.

采用CCK8实验检测稳定表达外源CapG的AGS细胞与对照细胞间的细胞增殖速度差异, 并绘制生长曲线, 结果显示, 过表达CapG后AGS细胞的生长速度略低于对照组(P=0.073), 但二者之间差异无统计学意义, 提示过表达CapG并不影响AGS细胞的生长和增殖(图6)。

图6

Figure 6

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图6 过表达CapG对AGS细胞增殖的影响(3次重复实验)Figure 6 Effects of overexpression of CapG on proliferation of AGS cells (3 repeated experiments) Abbreviations as in Figure 2.

采用细胞划痕实验和Transwell小室实验检测稳定表达CapG的AGS细胞的迁移能力, 划痕12 h后, 对实验组和对照组细胞的迁移距离进行统计(表1), 过表达CapG的AGS细胞的划痕间距明显小于对照组细胞(P=0.004, 图7A), 提示CapG过表达可明显促进细胞的迁移速度。进一步通过Transwell小室实验比较过表达CapG组与对照组细胞的穿膜细胞数目, 并对实验组和对照组细胞的穿膜数目进行统计分析(表2), 结果表明, 过表达CapG实验组穿膜细胞数目显著多于对照组(P=0.001, 图7B), 过表达CapG能显著促进胃癌细胞系AGS的迁移能力。

图7

Figure 7

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图7 过表达CapG对胃癌AGS细胞系迁移能力的影响Figure 7 Effects of overexpression of CapG on migration of gastric cancer cell line AGS Abbreviations as in Figure 2. A, cell scratch test; B, transwell experiment (3 repeated experiments). * P< 0.001 vs. eGFP.

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 划痕实验的细胞迁移距离 Table 1 Cell migration distance of scratch test Group Cell migration distance/μ m 1 2 3 Mean CapG 0 h 736.25 762.50 742.47 747.07 12 h 371.25 443.76 415.23 410.08 Difference 365.00 318.74 327.24 336.99 eGFP 0 h 687.52 713.78 702.53 701.28 12 h 652.27 661.22 653.72 655.74 Difference 35.25 52.56 48.81 45.54 Abbreviations as in Figure 2.

表1 划痕实验的细胞迁移距离 Table 1 Cell migration distance of scratch test

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 迁移实验的细胞穿膜数目 Table 2 The number of cell penetrating membrane Number of trials Number of cell penetrating membrane eGFP CapG 1 78 182 2 64 176 3 67 171 Mean 70 176 Abbreviation as in Figure 2.

表2 迁移实验的细胞穿膜数目 Table 2 The number of cell penetrating membrane