引用本文
孙睿, 高波, 郭传瑸. 裸小鼠淋巴结的解剖和组织学特点. 北京大学学报(医学版), 2017,49(5): 893-898.
SUN Rui, GAO Bo, GUO Chuan-bin. Anatomy and histology characteristics of lymph node in nude mice. Journal of Peking University(Health Sciences), 2017,49(5): 893-898.  
Doi: 10.3969/j.issn.1671-167X.2017.05.027
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Copyright©2017, 北京大学
《北京大学学报（医学版）》编辑部
裸小鼠淋巴结的解剖和组织学特点
孙睿1, 高波2, 郭传瑸3
1. 山西省人民医院口腔颌面外科,太原 030012
2. 山西医科大学口腔医院口腔颌面外科,太原 030001
3. 北京大学口腔医学院·口腔医院,口腔颌面外科 口腔数字化医疗技术和材料国家工程实验室 口腔数字医学北京市重点实验室,北京 100081
收稿日期: 2017-04-27
基金资助: 国家自然科学基金(30872899)和山西省自然科学基金(2011011037)资助
摘要

目的 研究裸小鼠淋巴结的解剖学和组织学特点。方法 使用手术显微镜解剖20只BALB/c裸小鼠和20只BALB/c小鼠,通过免疫组织化学方法比较了两者淋巴结中T淋巴细胞和B淋巴细胞表达的不同。结果 平均每只裸小鼠中包含23个淋巴结和一组大型淋巴结群。裸小鼠颈部淋巴结分布密度较高,其中颌下淋巴结及颈浅淋巴结在裸小鼠中大多数为2个(构成比分别为95%和90%),而在小鼠中大多数为4个(构成比分别为95%和90%),两者差异有统计学意义。无论小鼠还是裸小鼠的颈深淋巴结均为2个(构成比分别为100%和95%),两者差异无统计学意义。裸小鼠淋巴结中CD3阳性的T淋巴细胞减少。细胞膜和细胞质着色的CD3阳性表达的T细胞在裸小鼠的表达阳性率为15%,在小鼠的表达阳性率为100%,两者表达的差异有统计学意义。细胞膜阳性表达CD20的B细胞在裸小鼠中的阳性率为95%,在小鼠中的阳性率为100%,两者表达的差异无统计学意义。结论 裸小鼠淋巴结分布的解剖图对于初学者有一定的帮助,裸小鼠颈部淋巴结密度较高的解剖学特点和缺乏CD3阳性的T淋巴细胞将有助于更好地理解裸小鼠的淋巴结转移机制。

关键词: 裸小鼠; 淋巴结; 解剖学
中图分类号:R-332 文献标志码:A 文章编号:1671-167X(2017)05-0893-06
Anatomy and histology characteristics of lymph node in nude mice
SUN Rui1, GAO Bo2, GUO Chuan-bin3
1. Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Shanxi Provincial People’s Hospital, Taiyuan 030012, China
2. Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Shanxi Medical University School of Stomotology, Taiyuan 030001, China
3. Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Peking University School and Hospital of Stomatology & National Engineering Laboratory for Digital and Material Technology of Stomatology & Beijing Key Laboratory of Digital Stomatology, Beijing 100081, China
△ Corresponding author’s e-mail, guodazuo@sina.com
Fund:Supported by the National Natural Science Foundation of China (30872899) and the Natural Science Foundation of Shanxi Province (2011011037)
Abstract

Objective: To compare the differences of anatomical and histological characteristics of lymph nodes between BALB/c nude mice and BALB/c mice.Methods: Firstly, twenty BALB/c nude mice and twenty BALB/c mice were dissected by using a surgical microscope. Secondly, the differences of T cells and B cells at the lymph node were compared by the expressions of CD3 and CD20 immunohistochemistry dyes.Results: There were, on average, 23 nodes per mouse contained within the large lymph node assembly in the BALB/c nude mouse. The anatomical features of the lymph node distribution in the nude mice were mainly found in the neck with relatively higher density. There were two lymph nodes both in the submandible lymph nodes group and in the superficial cervical lymph nodes group (the constituent ratios were 95% and 90%, respectively) in the BALB/c nude mice, but there were four lymph nodes (the constituent ratios were 95% and 90%, respectively) in the BALB/c mice. There were significant difference between the BALB/c nude mice and the BALB/c mice. Mostly there were two lymph nodes of deep cervical lymph nodes both in the BALB/c nude mice and the BALB/c mice (the constituent ratios were 95% and 100%, respectively). There were no significant difference between the BALB/c nude mice and the BALB/c mice. We confirmed that the number of CD3-positive T lymphocytes in lymph nodes of the nude mice decreased greatly as compared with the BALB/c mice. Expressions of CD3 in T cells were 95% and 100% in the BALB/c nude mice and in the BALB/c mice, respectively. There were significant differences between the BALB/c nude mice and the BALB/c mice. Expressions of CD20 in B cells were 95% and 100% in the BALB/c nude mice and in the BALB/c mice, respectively. There was no significant difference between the BALB/c nude mice and BALB/c mice.Conclusion: The anatomical pictures of lymph node distribution in the nude mouse will be benefit to those who are interested. The anatomical features of the lymph node local higher density in neck of the nude mouse and lack of CD3-positive T lymphocytes would be useful for obtaining a better understanding of localized lymph node metastasis of oral transplant tumors.

Key words: Nude mice; Lymph nodes; Anatomy

1968年, Pantelouris[1]发现了裸鼠nu基因突变导致了裸鼠无胸腺和无毛发的特点, 虽然其毛小球正常但是毛囊的不正常角化导致了短小弯曲的毛发生长在表皮上[2], 胸腺发育到11.5 d时胸腺外胚层细胞停止发育[3], 淋巴滤泡中胸腺依赖的T淋巴细胞也消失, 外周血中的淋巴细胞明显下降。1969年, Rygaard 等[4]首先在裸鼠上建立了肿瘤细胞种植模型, 标志着裸鼠作为研究免疫缺陷的动物模型具有一定的研究价值。

裸鼠是经常作为肿瘤动物模型的实验动物, 特别是在研究肿瘤的侵袭和转移的过程中。肿瘤的侵袭和转移研究有体外实验和体内实验, 体外实验可以简单模拟肿瘤细胞的侵袭现象但是不能替代体内实验[5, 6]。

目前裸鼠的异体移植动物模型是研究肿瘤细胞淋巴结转移的主要方法, 特别是正位种植技术的扩展使用[7, 8, 9, 10], 但是目前尚未见显示裸鼠的淋巴结分布及数目的明确资料。本研究通过解剖20只BALB/c裸小鼠和BALB/c小鼠比较其淋巴结的组织学和解剖学特点。

1 材料与方法
1.1 实验动物

20只BALB/c裸小鼠(动物品名CRL: BALB/c AnNCrl-nuBR)和20只BALB/c小鼠均购自北京维通利华有限公司(北京大学医学部实验动物部)。裸小鼠饲养环境为SPF级别。裸小鼠的雌雄性别比例为1 :1, 小鼠均为雄性, 均为12~13周龄。本研究获得北京大学生物医学伦理委员会批准。

1.2 仪器

采用的主要仪器有外科手术显微镜[Opton Universal S3(德国)]、显微外科器械(上海金钟牌)和游标卡尺。

1.3 实验方法

采用放大4倍的外科手术显微镜解剖裸小鼠和裸鼠的全部淋巴结, 淋巴结均经过10%(体积分数)甲醛溶液固定48 h、梯度酒精脱水、石蜡包埋、3 μ m厚切片、苏木素-伊红染色的步骤。由病理科医师在显微镜下观察组织切片。

1.4 免疫组织化学法

应用免疫组织化学Envision PV-9001 PowerVisionTM 二步法进行染色。所有组织切片常规脱蜡, 磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline, PBS)洗涤3次, 每次5 min。在pH 6.0(0.01 mol/L)的枸橼酸钠缓冲液中进行抗原热修复, 自然冷却30 min, PBS冲洗5 min× 3次。将切片浸泡于用PBS稀释到3%(体积分数)的过氧化氢中20 min, PBS冲洗5 min× 3次。滴加一抗(Anti-CD20, sc-7735, 羊多克隆抗体, 体积比1 :100稀释, Santa Cruz, Europe; Anti-CD3 Gamma, 兔单克隆抗体, 体积比1 :80稀释, Epitomics, California, USA ), 4 ℃过夜。第2天取出切片常温放置3 min, PBS冲洗 5 min× 3次。滴加PV-9001试剂二抗(poly-HRP-anti Goat IgG; poly-HRP-anti rabbit IgG), 37 ℃水浴20 min, PBS冲洗5 min× 3次, 滴加PV-9001试剂, 37 ℃水浴20 min, PBS冲洗5 min× 3次。DAB显色, 苏木素复染, 梯度乙醇溶液及二甲苯脱水, 树胶封片。已知阳性的组织标本作为阳性对照, PBS代替一抗作为阴性对照。实验结果由2名病理科医师双盲判定。

1.5 结果判定

细胞质出现棕黄色颗粒状或片状染色为阳性细胞。计数5个高倍视野, 每例至少评价1 000个细胞, 按细胞着色强度和着色密度分别进行评分。按着色强度评分:轻度着色为1分, 中度着色为2分, 重度着色为3分。按着色密度评分:阳性细胞百分率< 10%为1分, 10%~49%为2分, 50%~79%为3分, ≥ 80%为4分。将2项得分相乘得到总评分, 总评分1~3分为阴性(-), 4~6分为弱阳性(+), 7~9分为阳性(++), 10~12分为强阳性(+++)。

1.6 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件。淋巴结直径的比较采用独立样本t检验, 淋巴结数目的比较采用Crosstabs test中的Pearson chi-square 和Fisher精确检验。CD20和CD3免疫组织化学结果采用秩和检验。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 裸小鼠中淋巴结的分布

裸小鼠包含12组淋巴结。(1)颌下淋巴结:每侧的颌下淋巴结包含1~2个淋巴结, 位于颌下腺的前侧方(图1A)。(2)颈浅淋巴结:位于气管区或者颈外静脉后方, 每侧约1~2个淋巴结(图1A)。(3)颈深淋巴结:位于气管中段胸骨甲状腺肌深部, 每侧有1~2个淋巴结(图1B)。(4)腋窝淋巴结:包括固有淋巴结和附属淋巴结。每侧各有1个, 固有淋巴结位于腋窝动静脉和背阔肌腹侧之间, 被躯干皮肌覆盖。腋窝附属淋巴结位于肱三头肌后缘和躯干皮肌之间的脂肪, 位置紧贴皮下层(图1C)。(5)纵隔淋巴结:位于主动脉弓前方和前腔静脉的侧面, 包含1~2个淋巴结(图1D)。(6)腰淋巴结:包括腹主动脉旁的淋巴结, 每侧各有1个, 以及肾门淋巴结(图1E)。肾门淋巴结位于腹主动脉分叉起始端前方, 约1~2个。(7)腹腔淋巴结:包括若干胃-十二指肠-胰淋巴结(图1E)。(8)肠系膜淋巴结:包括1组大的淋巴结群, 位于肠系膜的起点处, 和一些小的淋巴滤泡, 分散在空肠、回肠、结肠壁上(图1F), 这个较大的淋巴结群组由5~6个淋巴滤泡融合成。(9)荐髂淋巴结:包括髂内淋巴结和腹下荐淋巴结, 髂内淋巴结位于腹主动脉末端的侧方, 腹下荐淋巴结位于髂动脉汇合处(图1G)。(10)坐骨淋巴结:位于坐骨结节侧方坐骨神经上方, 通常为1个(图1H)。(11)腘淋巴结:位于腓肠肌外侧头腘窝内, 通常为1个(图1I)。(11)腹股沟淋巴结:位于腹股沟紧贴皮下, 通常为1个, 分离时容易连同皮肤剥离掉(图1J)。

图1 裸小鼠淋巴结分布的解剖图Figure 1 The distribution of nude mice lymph node dissection
A, lymphonodi mandibulares (black arrow), lymphonodi cervicales superficiales (blue arrow); B, lymphonodi cervicales profundi; C, internal axillary lymph nodes (black arrow), accessory axillary lymph nodes (blue arrow); D, lymphonodi mediastinales; E, lymphonodi lumbales (black arrow), lymphonodi celiaci (blue arrow); F, lymphonodi mesenterici; G, lymphonodi sacroiliaci (contain three nodes); H, lymphonodi ischiadici; I, lymphonodi poplitei; J, lymphonodi inguinales.

2.2 裸小鼠和小鼠淋巴结大体解剖区别

BALB/c裸小鼠和BALB/c小鼠淋巴结的大体解剖基本相近, 不同之处在于裸小鼠的淋巴结较少, 体内脂肪含量少, 很容易计数, 规律性强, 通过图片容易掌握; 而BALB/c小鼠的淋巴结较多, 体内脂肪较多, 脂肪组织包绕淋巴结, 较难计数, 规律性不强。

裸小鼠的颈部淋巴结群分组固定, 包括颌下淋巴结、颈浅淋巴结、颈深淋巴结, 裸小鼠和小鼠的颈部淋巴结群分组的直径大小没有明显差异(表1)。比较裸小鼠和小鼠的淋巴结数目发现, 除颈深淋巴结群外, 裸小鼠的颌下淋巴结及颈浅淋巴结明显少于小鼠相应的淋巴结, 两者差异有统计学意义(表2)。其中, 颌下淋巴结及颈浅淋巴结在裸鼠中大多数为2个(构成比分别为95%和90%), 而在小鼠中大多数为4个(构成比分别为95%和90%), 两者差异有统计学意义(表2)。无论小鼠还是裸小鼠的颈深淋巴结均为1个(构成比分别为100%和95%), 两者差异无统计学意义。

表1 BALB/c裸小鼠和BALB/c小鼠颈部淋巴结直径的比较 Table 1 Comparison of lymph nodes diameter between BALB/c nude mice and BALB/c mice
表2 BALB/c裸小鼠和BALB/c小鼠颈部淋巴结数目的比较 Table 2 Comparison of lymph nodes number in the neck area between BALB/c nude mice and BALB/c mice
2.3 裸小鼠和小鼠淋巴结显微镜下的组织学差异

裸小鼠淋巴结的组织结构模糊不清, 皮质、髓质界限不清楚, 有时难以分辨。小鼠淋巴结的组织结构清晰, 生发中心、皮质、髓质结构明显, 与人类的淋巴结很近似。

2.4 T淋巴细胞表达差异

采用免疫组织化学法, T淋巴细胞显示CD3表达阳性, 细胞膜和细胞质着色的CD3阳性表达的T细胞在裸小鼠的表达阳性率为15%(图2), 在小鼠的表达阳性率为100%(图3), 两者的表达差异有统计学意义(表3)。

表3 BALB/c裸小鼠和BALB/c小鼠T细胞、B细胞免疫组织化学的表达 Table 3 Expression of T cells and B cells between BALB/c nude mice and BALB/c mice

图2 BALB/c裸鼠中T淋巴细胞分布(C, 细胞膜和细胞质表达 × 40)Figure 2 T lymphocytes scattered in lymph nodes of BALB/c mice (C, cell membrane and cytoplasm expression × 40)

图3 BALB/c小鼠中T淋巴细胞分布在副皮质区(C, 细胞膜和细胞质表达 × 40)Figure 3 T lymphocytes in germinal center of BALB/c mice vice cortex distribution (C, cell membrane and cytoplasm expression × 40)

2.5 B淋巴细胞表达差异

采用免疫组织化学法, B淋巴细胞显示CD20表达阳性, 细胞膜阳性表达CD20的B细胞在裸小鼠中的阳性率为95%(图4), 在小鼠中的阳性率为100%(图5), 两者表达差异无统计学意义(表3)。

图4 BALB/c裸鼠中B淋巴细胞缺失(C D20-, 细胞膜表达 × 40)Figure 4 B lymphocyte in BALB/c nude mice (C D20-, cell membrane expression × 40)

图5 BALB/c小鼠中B淋巴细胞分布在浅层皮质(C D20+, 细胞膜表达 × 40)Figure 5 B lymphocytes distributed in BALB/c mice (C D20+, cell membrane express × 40)

3 讨论

本研究主要展示了裸小鼠的淋巴结图谱, 同时发现裸小鼠淋巴结中CD3阳性T淋巴细胞数明显少于小鼠淋巴结。

以往文献资料未见有关裸小鼠的淋巴结解剖图谱, 本研究主要参考了文献[11], 以图片形式清晰展示了裸小鼠全身的淋巴结。通过解剖裸小鼠发现, 裸小鼠有23个淋巴结和1个大的淋巴结群。总体上看, 裸小鼠的淋巴结数目明显少于小鼠, 但是裸小鼠颈部的淋巴结密度大于身体其他部位的淋巴结密度, 适合作为淋巴结转移动物模型的研究。小鼠和裸小鼠的淋巴结体积大小相近, 本研究结果与Fossum[12]的报道一致。

T淋巴细胞和B淋巴细胞最初来源于骨髓和胎儿肝脏的造血干细胞, 这些细胞为淋巴干细胞, 来源于骨髓祖细胞, 可以分化为T淋巴细胞和B淋巴细胞。T淋巴细胞直接作用于靶细胞起到保护防御作用或者作用于其他免疫细胞来发挥防御功能, 它与巨噬细胞共同作用可以介导细胞免疫调节。B淋巴细胞产生抗体来产生免疫作用, 是体液免疫的主要细胞, 也可通过抗原递呈作用使T细胞发挥作用。

淋巴滤泡通常是含有大量的B淋巴细胞, T淋巴细胞存在于副皮质区。本研究发现, 裸小鼠缺乏CD3γ 阳性的T淋巴细胞, 本结果与MacDonald等[13]和Scheid等[14]报道的结果相一致。最近有文献报道显示, CD3γ 阳性的T淋巴细胞可以阻止肿瘤细胞的转化[15]。

Dunn等[16]最初提出了免疫编辑的概念。免疫编辑包括免疫清除、免疫均衡、免疫逃避3个阶段, 淋巴细胞在免疫清除阶段发挥作用。裸小鼠因缺乏T淋巴细胞而不能及时清除肿瘤细胞。

裸小鼠目前是最常使用的研究肿瘤细胞淋巴转移的动物模型。以往有研究将肿瘤细胞注射入小鼠的后足肉蹼以观察肿瘤细胞是否转移至腘淋巴结, 也有研究将肿瘤细胞种植入口底区以观察口腔肿瘤的淋巴结转移[17], 该研究的理论依据有三, 第一, 口底种植模型符合口腔肿瘤转移方式, 第二, 颈部淋巴结密度较高, 转移容易发生, 第三, 裸小鼠缺乏CD3γ 阳性的T淋巴细胞, 导致肿瘤细胞不被清除而容易发生转移。Dinesman等[18]最早将肿瘤细胞种植于口底模拟口腔肿瘤的淋巴结转移模型, 此后也有大量相关研究报道[19, 20, 21]。

本研究展示了清晰的裸小鼠淋巴结图片, 有益于那些研究裸小鼠淋巴转移的初学者。裸小鼠颈部高密度的淋巴结群和缺乏CD3γ 阳性的T淋巴细胞可以解释口腔肿瘤原位移植后高淋巴结转移的现象。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
[1] Pantelouris EM. Absence of thymus in a mouse mutant[J]. Nature, 1968, 217(5126): 370-371. [本文引用:1]
[2] Kurooka H, Segre JA, Hirano Y, et al. Rescue of the hairless phenotype in nude mice by transgenic insertion of the wild-type Hfh11 genomic locus[J]. Int Immunol, 1996, 8(6): 961-966. [本文引用:1]
[3] Cordier AC, Haumont SM. Development of thymus, parathyroids, and ultimo-branchial bodies in NMRI and nude mice[J]. Am J Anat, 1980, 157(3): 227-263. [本文引用:1]
[4] Rygaard J, Povlsen CO. Heterotransplantation of a human malignant tumour to “Nude” mice[J]. Acta Pathol Microbiol Scand , 1969, 77(4): 758-760. [本文引用:1]
[5] Kramer RH, Bensch KG, Wong J. Invasion of reconstituted basement membrane matrix by metastatic human tumor cells[J]. Cancer Res, 1986, 46(4 Pt 2): 1980-1989. [本文引用:1]
[6] Schor SL, Schor AM, Winn B, et al. The use of three-dimen-sional collagen gels for the study of tumour cell invasion in vitro: experimental parameters influencing cell migration into the gel matrix[J]. Int J Cancer, 1982, 29(1): 57-62. [本文引用:1]
[7] Horinaga M, Harsch KM, Fukuyama R, et al. Intravesical interleukin-12 gene therapy in an orthotopic bladder cancer model[J]. Urology, 2005, 66(2): 461-466. [本文引用:1]
[8] Kawashiri S, Kumagai S, Kojima K, et al. Development of a new invasion and metastasis model of human oral squamous cell carcinomas[J]. Eur J Cancer B Oral Oncol, 1995, 31B(4): 216-221. [本文引用:1]
[9] Matsui T, Ota T, Ueda Y, et al. Isolation of a highly metastatic cell line to lymph node in human oral squamous cell carcinoma by orthotopic implantation in nude mice[J]. Oral Oncol, 1998, 34(4): 253-256. [本文引用:1]
[10] Schmitz V, Tirado-Ledo L, Tiemann K, et al. Establishment of an orthotopic tumour model for hepatocellular carcinoma and non-invasive in vivo tumour imaging by high resolution ultrasound in mice[J]. J Hepatol, 2004, 40(5): 787-791. [本文引用:1]
[11] 杨安峰, 王平. 大鼠的解剖和组织[M]. 北京: 科学出版社, 1985. [本文引用:1]
[12] Fossum S. Differences between lymph node structure and function in normal and athymic rats[J]. Curr Top Pathol, 1990, 84(Pt 1): 65-83. [本文引用:1]
[13] MacDonald HR, Lees RK, Sordat B, et al. Age-associated increase in expression of the T cell surface markers Thy-1, Lyt-1, and Lyt-2 in congenitally athymic (nu/nu) mice: analysis by flow microfluorometry[J]. J Immunol, 1981, 126(3): 865-870. [本文引用:1]
[14] Scheid MP, Goldstein G, Boyse E. Differentiation of T cells in nude mice[J]. Science, 1975, 190(19): 1211-1213. [本文引用:1]
[15] Ohman J, Mowjood R, Larsson L, et al. Presence of CD3-positive T-cells in oral premalignant leukoplakia indicates prevention of cancer transformation[J]. Anticancer Res, 2015, 35(1): 311-317. [本文引用:1]
[16] Dunn GP, Bruce AT, Ikeda H, et al. Cancer immunoediting: from immunosurveillance to tumor escape[J]. Nat Immunol, 2002, 3(11): 991-998. [本文引用:1]
[17] Sun R, Zhang JG, Guo CB. Establishment of cervical lymph node metastasis model of squamous cell carcinoma in the oral cavity in mice[J]. Chin Med J (Engl), 2008, 121(19): 1891-1895. [本文引用:1]
[18] Dinesman A, Haughey B, Gates GA, et al. Development of a new in vivo model for head and neck cancer[J]. Otolaryngol Head Neck Surg, 1990, 103(5 Pt 1): 766-774. [本文引用:1]
[19] Kawashiri S, Kojima K, Kumagai S, et al. Effects of chemotherapy on invasion and metastasis of oral cavity cancer in mice[J]. Head Neck, 2001, 23(9): 764-771. [本文引用:1]
[20] Simon C, Nemechek AJ, Boyd D, et al. An orthotopic floor-of-mouth cancer model allows quantification of tumor invasion[J]. Laryngoscope, 1998, 108(11 Pt 1): 1686-1691. [本文引用:1]
[21] Zhang X, Liu Y, Gilcrease MZ, et al. A lymph node metastatic mouse model reveals alterations of metastasis-related gene expression in metastatic human oral carcinoma sublines selected from a poorly metastatic parental cell line[J]. Cancer, 2002, 95(8): 1663-1672. [本文引用:1]