胚胎植入已成为生殖医学研究领域中尚未解决的热点问题, 胚胎植入需要胚泡和子宫内膜之间的通讯和相互协同作用, 被认为是调控女性生育和发展避孕方法最理想的靶点和最关键的环节, 与人类生殖健康关系密切^[7]。目前, 在滋养层细胞侵润过程、影响因素、调控因子及细胞与分子机制等研究方面已取得了一些进展, 表明免疫识别、血管发生、细胞凋亡和细胞外基质水解是与胚胎植入和胎盘形成中同步协调发生的关键过程^[8]。

囊胚极性与胚胎植入方向性关系密切, 人受精卵发育到第5天囊胚已经具有极性, 分化为内细胞团和滋养层细胞, 包绕内细胞团的是极滋养层细胞, 包绕胚泡腔的是壁滋养层细胞^[9]。啮齿类的胚胎是在子宫对系膜区着床, 内细胞团位于系膜侧, 最初与母体子宫内膜接触的是壁滋养层细胞。人及灵长类的胚胎是在系膜侧偏心区着床, 最初与母体子宫内膜接触的是极滋养层细胞^[10]。在非人灵长类, 极滋养层在附着到子宫内膜形成初级着床位点时, 胚体仍部分暴露于子宫表面, 胚体对侧的壁滋养层细胞附着到对侧子宫壁, 形成次级着床位点, 随后发育为次级胎盘, 这与啮齿类相似^[11]。

极滋养层细胞位于内细胞团外侧, 是人类囊胚植入子宫内膜的滋养层细胞, 具有重要生理作用。本研究采用无监督聚类分析, 极滋养层细胞基因表达不同于壁滋养层细胞, 极滋养层细胞有306个基因表达上调。极滋养层细胞差异表达基因主要与转录、能量代谢、氧化应激、离子转运、蛋白合成及运输等生物功能有关。

极滋养外胚层突起与蛋白水解:本研究发现RPS19、RPS23、RPL26L1等30个基因的生物学作用是参与细胞伸展和突起(图5A)。受精第6天的囊胚处于即将孵化时期, 囊胚极滋养层细胞膜在局部区域会形成突起向外伸展, 称为滋养外胚层突起(trophectodermal projections, TEPs), TEPs具有高度的伸展性, 可长达17 μ m, 能通过卵周隙穿透5 μ m 厚的透明带, 引起透明带局部或整体裂解^[12]。TEPs在穿透透明带过程中引起的透明带裂解, 还需要透明带溶解分子(如组织蛋白酶、水解酶、肽酶、环氧合酶等)参与^[13]。极滋养层细胞特异基因CPSF2, SMARCA4, DDX6等17个基因分子功能包含这些蛋白酶活性(表1), 说明其在囊胚孵化过程中可能通过TEPs向透明带运输自身分泌的蛋白酶来溶解透明带。

极滋养层细胞吞噬与氧化应激: 研究发现TCOF1、NDUFA7、KHSRP等20个极滋养层细胞特异表达基因参与运输功能, 这种功能是通过吞噬完成的, 囊胚阶段极滋养层细胞吞噬凋亡细胞和蜕膜细胞碎片, 获得发育所需要营养和空间, 同时也清除有害粒子和病原体, 是胚胎植入子宫内膜和组织重塑生理过程的关键环节^[14]。这种现象只发生于靠近内细胞团的极滋养层细胞, 而在啮齿类动物只发生于壁滋养层细胞, 恰恰是囊胚植入位置^[15], 也说明单细胞检测结果与形态学研究结果相一致。低氧条件下与对照细胞株相比较, 自噬缺陷型细胞株HTR8细胞侵袭能力和血管生成能力明显降低, 进而导致胎盘浅着床和螺旋动脉重塑障碍^[16]。

极滋养层细胞细胞周期与增殖:极滋养层细胞特异表达基因中有36个基因功能是DNA依赖转录功能, 另有37个基因功能是转录功能, 说明极滋养层细胞比较快速的增殖与分化。极滋养层细胞特异基因的生物学功能还包括蛋白质合成、蛋白质剪切、蛋白质折叠, rRNA加工、RNA聚合酶Ⅱ 启动子的RNA延伸、RNA聚合酶Ⅱ 启动子的转录起始、RNA剪接、核mRNA剪接体剪接等, 显示了极滋养层细胞在胚胎植入中的特殊功能。

本研究极滋养层细胞特异基因KEGG信号通路分析显示, 这些特异基因参与泛素介导的蛋白水解、氧化磷酸化、Wnt信号通路、雌雄激素代谢等信号通路(表3)。泛素介导的蛋白水解对于细胞分化、细胞器生物合成、细胞凋亡、DNA修复、新蛋白生成、调控细胞增殖、蛋白质输运、免疫应答和应激反应等生理过程, 都起到很重要的作用^[17]。可逆的氧化磷酸化过程几乎涉及所有的生理及病理过程, 如细胞信号转导、肿瘤发生、新陈代谢、神经活动、肌肉收缩以及细胞增殖发育和分化等^[18]。Wnt信号通路可能是通过影响滋养层细胞, 进而影响了囊胚的孵化^[19]。极滋养层细胞特异基因参与雌激素和雄激素代谢, 适当的雌激素和雄激素调节胚胎发育和子宫内膜容受的同步性, 同时也在免疫识别和耐受调控中起到一定作用, 主要影响细胞因子的合成和局部淋巴细胞中NK细胞的功能^[20]。

壁滋养层细胞是覆盖胚泡位于内细胞团对侧的滋养层细胞, 采用无监督聚类分析, 壁滋养层细胞基因表达明显不同于极滋养层细胞, 壁滋养层细胞有75个基因表达上调, 差异表达基因主要与蛋白分解代谢、细胞周期停滞、细胞凋亡、激活MAPK、碳水化合物运输、突触负调节、细胞生长、钙通道激活、正向B 细胞分化、T细胞凋亡等生物功能有关。

壁滋养层细胞特异基因TAOK2、GNAI2参与MAPKs信号通路, MAPKs中每个分子均出现于植入前早期胚胎中, 并调控着早期胚胎发育和对环境的适应性^[21]。研究发现MAPKs也是囊胚扩张和孵化的重要调控因子, 将MAPKs抑制因子SB220025与早期胚胎共培养, 会使得滋养层细胞之间紧密连接的通透性明显升高, 水通道蛋白表达降低, 减少液体在囊胚腔积累, 进而影响了囊胚的扩张和孵化^[22]。壁滋养层细胞特异基因TP53INP1、MFSD10、TAOK2、DPF2、C11orf82参与细胞凋亡。细胞凋亡是胚胎植入过程中在蜕膜和滋养层细胞中发生的一种非常普遍现象。人胎盘表达TNF2α 和IFN2γ , 前者能诱导滋养层细胞凋亡, 而后者能促进这一过程^[23], 滋养层细胞表达的EGF 能抑制它的凋亡, 显示壁滋养层细胞在囊胚孵化和胚胎植入过程中精细控制凋亡、侵袭、免疫耐受及血管生成等生理功能。

壁滋养层细胞特异基因CDK5、BARD1参与核的蛋白质输出的负调节, GCLC、AKT1参与阳性调节蛋白酶体泛素依赖性蛋白质分解代谢过程, GCLC、CDK5参与负调节蛋白质泛素化, PDE8A、DLX3、ZNF7、NFYA、HES6、DPF2、EED参与DNA依赖调节转录, CGRRF1、C11orf82、BARD1、CAPG、PKMYT1、CGRRF1参与细胞周期调节。壁滋养层特异基因共同调节囊胚孵化和胚胎植入过程中的蛋白水解及滋养层细胞侵润能力。胚胎植入的重要标志是滋养层细胞向子宫内膜侵入, 滋养层细胞不断分裂并与合体滋养层融合, 使后者不断向外扩张以至于发生中空形成初级绒毛^[24]。本研究结果显示壁滋养层细胞在胚胎植入中协同极滋养层细胞和子宫内膜, 发生有限、精细调控的细胞外基质局部降解, 并伴随组织重塑和改建, 显示壁滋养层细胞在时间和空间上协调囊胚孵化和胚胎植入过程, 壁滋养层细胞可能同时参与并精细调节几个生物学过程, 某些特异基因是某一过程的激活因子同时也是另外过程的抑制因子。

本研究壁滋养层细胞特异基因KEGG信号通路分析显示, 这些特异基因参与B细胞受体、T细胞受体、白细胞跨内皮移植、VEGF、间隙连接、GnRH、细胞凋亡等信号通路。壁滋养层细胞特异基因表达可能调节T细胞、B细胞和中性粒细胞, 调节母体对子代的同种异体移植的免疫响应, 同时通过调控细胞因子的表达来调节滋养层细胞的侵袭和胎盘形成。B细胞和中性粒细胞在抗原递呈、维持炎性平衡, 多因子相互协调促进胚胎植入^[25]。壁滋养层细胞特异基因参与VEGF信号通路, 对胚胎黏附和发育以及母胎界面细胞外基质黏附作用均有重要影响, 另外VEGF信号通路在胚胎植入早期母胎界面基底部、螺旋动脉内皮细胞、腺上皮细胞都有特异表达。正常有序的血管发生对胚胎植入和胎盘形成至关重要, 异常血管发生将阻断胚胎植入和导致多种妊娠疾病^[26], 说明壁滋养层细胞参与胚胎植入过程中血管新生和母胎界面蜕膜组织血管通透性的调节。

综上所述, 关于胚胎植入和异位妊娠研究表明, 对胚胎植入起关键作用的基因和分子可能不是来源于母体, 而是来源于胚胎, 母胎界面组织只是提供胚胎发育的载体。既往的研究多将胚胎滋养层细胞作为一个整体, 研究基因表达时间顺序演变, 进行缺少细胞基因表达空间研究, 本研究对人胚胎植入前囊胚极/壁滋养层细胞进行基因表达分析, 发现人类胚胎是极滋养层细胞着床, 其特异表达基因主要参与转录、能量代谢、氧化应激、离子转运、蛋白合成及运输、细胞周期调节、肌动蛋白增长等生物功能, 以及泛素介导的蛋白水解、氧化磷酸化、Wnt信号通路、雌雄激素代谢等信号通路。壁滋养层细胞特异表达基因主要参与蛋白分解代谢、细胞周期停滞、细胞凋亡、激活MAPK、碳水化合物运输、突触负调节、细胞生长、钙通道激活、正向B 细胞分化、T细胞凋亡等生物功能, 以及B细胞受体、T细胞受体、白细胞跨内皮移植、VEGF、间隙连接、GnRH、细胞凋亡等信号通路, 显示胚胎植入在空间上的复杂调控、精细平衡、协调同步的生理过程需要极/壁滋养层细胞相互协调共同完成。

(志谢:北京大学第三医院生殖中心提供病例标本来源, 特此致谢!)