实验中所采用的溶胶-凝胶法制备的58S纳米生物活性玻璃(nano-sized 58S bioactive glass, nano-58S BG, 化学组分摩尔百分比为58% SiO₂, 33% CaO, 9% P₂O₅)和传统的熔融法制备的45S5生物活性玻璃(45S5 BG, 化学组成摩尔百分比为45%SiO₂, 24.5%CaO, 6%P₂O₅和24.5%Na₂O)由华南理工大学生物医学工程中心制备, nano-58S的制备是将一定量的前驱体正硅酸乙酯(tetraethyl orthosilicate, TEOS)、四水硝酸钙(calcium nitrate tetrahydrate, CN)、磷酸氢二氨[(NH₄)₂HPO₄]、磷酸三乙酯(triethylphosphate, TEP)等, 加入无水乙醇的乳酸溶液中形成均匀透明的溶胶, 并将氨水溶液加入上述溶胶, 同时剧烈搅拌, 促使溶胶凝胶共沉淀, 然后将沉淀进行漂洗和干燥, 再经600 ° C热处理2 h得到生物活性玻璃纳米颗粒^[24]。用场发射扫描电子显微镜观察两种生物活性玻璃颗粒的表面形貌。

实验动物为6~8周龄雄性普通级新西兰白兔, 体重 2.5~3.5 kg。实验动物的使用已通过北京大学生物医学伦理委员会实验动物福利伦理分会审查批准(伦理批准号:LA2011-057)。将20只新西兰大白兔的左右两侧顶骨编号1~40号, 使用随机表随机分为空白对照组、45S5组和nano-58S组。动物检疫合格, 适应环境1周后, 耳缘静脉注射2%(质量分数)戊巴比妥钠至全身麻醉, 无角膜反射, 呼吸平稳, 备皮后沿颅中缝做4 cm矢状方向切口, 分层剥离皮下组织暴露两侧平坦的顶骨骨面, 用取骨环钻在两侧顶骨制备直径9 mm双层皮质骨贯通骨缺损, 保留下方完整硬脑膜。沿骨缺损直径, 在缺损边缘2 mm外球钻制备凹坑至松质骨层, 填入银汞合金作为缺损边缘的参考标记点。根据随机分组, 伴随骨缺损内新鲜出血分别填入nano-58S生物活性玻璃粉末或45S5生物活性玻璃粉末, 与出血混合形成血凝块充盈骨缺损, 空白组不填入任何材料, 仅以新鲜出血形成的血凝块充盈骨缺损。皮下组织、皮肤分层缝合, 术后肌肉注射青霉素(10万U/kg)3 d, 并定期观察手术区域愈合情况。

1.2.1 骨荧光标记 对进行成骨速度观察的动物进行骨荧光标记, 利用药物在成骨过程中与矿化组织结合沉积并且能够自发荧光的特性, 在术后第14、28和42天依次在术区附近皮下注射不同的骨荧光标记药物, 随矿化沉积于新生骨, 以标记观察各组实验动物手术部位新生骨的成骨方向和速度, 注射顺序及注射剂量如表1所示, 术后8周进行标本取材。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 骨荧光药物注射表 Table 1 Injection of the fluorescent markers Time Marker Dosage/ (mg/kg) Concentration/% d14 Tetracycline hydrochloride 60 1 d28 Alizarin red 30 1 d42 Calcin 10 2

表1 骨荧光药物注射表 Table 1 Injection of the fluorescent markers

1.2.2 脱钙标本的制取及组织学切片 术后4周和8周取得顶骨标本, 常规固定, 脱钙, 从标本中央过银汞标记点分切标本, 修整边缘。每个样本包括半径4.5 mm的半圆形骨缺损区域和周围3 mm正常骨组织区域, 石蜡包埋, 制成组织学切片, 进行HE染色及天狼星红苦味酸染色, 天狼星红苦味酸染色封片后, 在偏振光显微镜下观察Ⅰ 型胶原纤维在骨缺损中的沉积和表达。

1.2.3 骨荧光标记的硬组织磨片制作与观察 将标本取材后, 固定、脱水、Technovit 7200 VLC树脂包埋, 光照24 h固化后用Exakt 300CL过标本两端银汞标志点沿矢状方向切取经过骨缺损中心的100 μ m 宽的组织, 打磨至30 μ m厚度, 进行激光共聚焦显微镜照相。采用盐酸四环素、茜素红、钙黄绿素相应的激发光激发硬组织磨片标本, 在共聚焦显微镜下可以分别观察到黄色、红色和绿色的自发荧光。在德国Zeiss, LSM 5 EXCITER共聚焦显微镜下ZenLightEdition软件设置光路(表2), 可在3种药物对应的自发荧光波段检测到荧光, 收集荧光, 在10倍物镜下进行观察和拍照。自由选择颜色进行赋色后导出图片, 药物对应的图片荧光颜色如表3所示。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 骨荧光药物自发荧光观察条件 Table 2 Observing wavelength of fluorescent markers /nm Excitation range Emission range Filter Dichroic mirror Tetracycline hydrochloride 390-425 525-560 405 635 Alizarin red 530-560 580 543 635 Calcin 501-506 531 488 635

表2 骨荧光药物自发荧光观察条件 Table 2 Observing wavelength of fluorescent markers /nm

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 骨荧光标记物赋色 Table 3 Coloring of fluorescent markers in figures Marker Color Time range of new bone formation Tetracycline hydrochloride Blue 2-4 weeks after surgery Alizarin red Red 4-6 weeks after surgery Calcin Green 6-8 weeks after surgery

表3 骨荧光标记物赋色 Table 3 Coloring of fluorescent markers in figures

1.2.4 骨组织形态定量分析 应用Image J(1.50i)对骨荧光磨片的荧光图像定量分析, 光学显微镜在100倍放大下, 每组5个标本, 选择每个标本骨缺损边缘和中央5个不同视野, 应用Image J测量每个标本4~6周及6~8周的新生骨形成宽度。

采用SPSS 22.0统计软件进行分析, 计量资料以均数± 标准差表示, 采用单因素方差分析比较各组间及组内差异, P< 0.05认为差异有统计学意义。

扫描电子显微镜观察可见, nano-58S BG颗粒为规则的球形颗粒, 粒径在20 nm左右(图1A), 45S5 BG颗粒形态不规则, 粒径在2~15 μ m之间(图1B)。与45S5 BG相比, nano-58S BG具备更大的比表面积和孔隙率^[24]。

图1

Figure 1

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	图1 生物玻璃颗粒的扫描电子显微镜观察Figure 1 FE-SEM of bioactive glass particulates

手术过程中未出现实验动物死亡, 术后30 min内动物苏醒, 进食、饮水和活动正常, 术后每周称重, 所有实验动物体重均正常上升。

手术后1~2 d术区无明显肿胀, 皮温略升高, 缝合伤口无开裂、流血、流脓现象。术后3 d术区皮温恢复正常, 术后5 d术区缝合伤口基本愈合, 术后14 d手术伤口完全愈合, 术区毛发生长明显。术后30 d顶骨区域毛发恢复正常, 手术区域情况稳定, 无异物排斥现象。

HE染色可以看到4周时45S5组和nano-58S组内可见生物活性玻璃颗粒周围有纤维组织或骨组织紧密包绕, 未见到急慢性炎性细胞浸润。缺损内有较多新骨形成, 并且缺损中央也可见到团块状新生骨的形成。对照组内可见少量新骨形成, 均是由缺损边缘开始向内形成, 骨缺损中央未见新骨形成(图2)。

图2

Figure 2

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	图2 4周组织切片HE染色Figure 2 HE staining at 4-week after surgery

8周时, nano-58S组和45S5组内可见更多新骨在缺损边缘和缺损中央形成, 骨缺损边缘和中央新生的团块骨为中间有空腔的结构, 与正常顶骨形态结构相似。对照组仍仅观察到自缺损边缘向中央爬行的新生骨, 多为实心团块状, 与正常顶骨的结构仍有较大差异(图3)。

图3

Figure 3

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	图3 8周组织切片HE染色Figure 3 HE staining at 8-week after surgery

术后8周的天狼星红苦味酸染色观察发现, 各组间Ⅰ 型胶原均充盈骨缺损区域, 随新骨的不断形成, 新生骨内部可见层状排列编织的Ⅰ 型胶原, 周围骨基质内也可见Ⅰ 型胶原的广泛表达。在相同曝光时间和感光强度下, nano-58S组显色亮度高于45S5组和对照组, 提示Ⅰ 型胶原表达量较高, 并且nano-58S组在骨缺损中央胶原编织厚度高于45S5组, 高于对照组。与对照组相比, nano-58S组和45S5组骨缺损边缘新生骨内部Ⅰ 型胶原的排列和编织更接近于正常颅骨的形态结构(图4)。

图4

Figure 4

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	图4 天狼星红苦味酸染色及偏振光观察(8周)Figure 4 Picric-sirius red staining and observation under polarimetry (8-week)

图5

Figure 5

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	图5 骨荧光磨片的激光共聚焦显微镜观察Figure 5 Fluorescent observation of the hard tissue slice with laser confocal microscope

激光共聚焦显微镜下观察骨硬组织磨片可见, 各组硬组织磨片内3种颜色荧光染色带均可见, 说明新骨的形成和矿化过程贯穿了8周的观察期。3种荧光带分布位置和范围不同, 其中蓝色荧光带标记2~4周的新骨形成区域在生物活性玻璃组和对照组中均最为广泛, 各组中4~6周新骨形成的红色荧光带和6~8周新骨形成的绿色荧光带呈带状分布, 依次沉积在成骨前沿的外侧。45S5组和nano-58S组在荧光带的融合图像中可以看到3种荧光带之间有一定范围的重叠, 并且绿色荧光带有部分沉积在红色荧光新生骨团块的中央, 显示出6~8周生物活性玻璃组在新生骨前沿的外侧成骨的同时, 新生骨团块的内部也有骨组织的改建和成熟。在对照组中未观察到明显的骨团块内部改建成熟的荧光带沉积。在相同激发光强度和曝光强度下观察可见, nano-58S组4~6周红色荧光带和6~8周绿色荧光带荧光强度均高于45S5组, 且高于空白对照组(图5)。

在100倍放大下分别拍摄3种荧光条带并获得条带融合照片, 用Image J图像软件测量新生骨条带的宽度并与对照组比较, 可见nano-58S组术后4~6周新骨形成宽度为(29.4± 4.48)μ m, 6~8周为(35.3± 3.74)μ m, 45S5组术后4~6周新骨形成宽度为(13.43± 3.44)μ m, 6~8周为(17.64± 4.13)μ m, 对照组术后4~6周新骨形成宽度为(5.88± 2.92)μ m, 6~8周为(6.07± 3.02)μ m, 数据经单因素方差分析, 组间差异有统计学意义(P< 0.01), 在4~6周和6~8周, nano-58S组新生骨宽度均显著高于45S5组, 并显著高于对照组。对同一组内不同时间段荧光带宽度进行比较分析可见, nano-58S组6~8周新骨形成宽度显著高于4~6周(P< 0.05), 45S5组6~8周新骨形成宽度高于4~6周, 但差异无统计学意义(P> 0.05)。