引用本文
李昀倩, 盛荟, 梁磊, 赵越, 李怀业, 白宁, 王彤, 袁兰, 韩鸿宾. 光磁双模态分子探针Gd-DO3A-EA-FITC在脑组织间隙成像分析中的应用. 北京大学学报(医学版), 2018,50(2): 221-225
LI Yun-qian, SHENG Hui, LIANG Lei, ZHAO Yue, LI Huai-ye, BAI Ning, WAN Tong, YUAN Lan, HAN Hong-bin. Application of anoptomagnetic probe Gd-DO3A-EA-FITC in imaging and analyzing the brain interstitial space. Journal of Peking University(Health Sciences), 2018,50(2): 221-225.  
Doi: 10.3969/j.issn.1671-167X.2018.02.004
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光磁双模态分子探针Gd-DO3A-EA-FITC在脑组织间隙成像分析中的应用
李昀倩1,2,3, 盛荟1,2,3, 梁磊1, 赵越2,3, 李怀业2,3, 白宁2,3,4, 王彤1,2,3, 袁兰1,△, 韩鸿宾3,△
1. 北京大学药学院化学生物学系, 北京 100191
2. 北京大学医药卫生分析中心, 北京 100191
3. 北京市磁共振成像设备与技术重点实验室, 北京 100191
4. 锦州医科大学药学院, 辽宁锦州 121000
5. 北京大学第三医院放射科, 北京 100191
收稿日期: 2017-11-13
资助项目: 国家重点研发计划(2016YFC0103605、2016YFC0103602、2016YFC0103600)、国家自然科学基金(91330103、91630314、81471633)、国家杰出青年基金(61625102)、北京市科技计划(Z161100000116041)、北京大学医学-工学交叉学科种子基金项目(BMU20120290)资助
摘要
目的:研究光磁双模态分子探针Gd-DO3A-ethylthiourea-fluorescein isothiocyanate(Gd-DO3A-EA-FITC)在脑组织间隙(interstitial space, ISS)成像分析中的应用价值。方法:24只SD雄性大鼠随机分为磁示踪组(6只)、荧光示踪组(6只)和光磁示踪组(12只),光磁示踪组随机分为磁示踪亚组(6只)和荧光示踪亚组(6只)。分别在大鼠尾状核区注入磁示踪剂钆-二乙三胺五乙酸(gadolinium-diethylene triamine pentaacetic acid, Gd-DTPA)、光示踪剂异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)和光磁双模态分子探针Gd-DO3A-EA-FITC,应用磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)检测示踪剂在脑ISS中的扩散和分布,利用自主研发的脑ISS图像处理系统测量Gd-DO3A-EA-FITC和Gd-DTPA在脑ISS内的扩散系数、清除率、体积分数和半衰期等扩散参数。注射示踪剂2 h后,利用激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope, LSCM)对离体脑切片进行荧光信号的采集,并对比分析斜矢状位切片中示踪剂扩散分布的最大面积。结果:Gd-DTPA和Gd-DO3A-EA-FITC在鼠脑内的平均扩散系数分别为(3.31±0.11)×10-4 mm2/s和(3.37±0.15)×10-4 mm2/s ( t=0.942, P=0.360),清除率分别为(3.04±0.37) mmol/L和(2.90±0.51) mmol/L ( t=0.640, P=0.531),体积分数分别为17.18%±0.14%和17.31%±0.15% ( t=1.961, P=0.068),半衰期分别为(86.58±3.31) min和(84.61±2.38) min ( t=1.412, P=0.177),扩散分布最大面积分别为(22.71±1.00) mm2和(23.25±0.68) mm2 ( t=1.100, P=0.297),两者的各项扩散参数差异均无统计学意义。FITC和Gd-DO3A-EA-FITC在鼠脑内扩散分布最大面积分别为(22.10±1.29) mm2和(22.61±1.16) mm2( t=0.713, P=0.492),两者差异无统计学意义,Gd-DO3A-EA-FITC的扩散面积略大于FITC。结论:Gd-DO3A-EA-FITC与传统的Gd-DTPA的成像结果相同,可用于ISS的测量。
关键词: 脑; 造影剂; 分子探针技术; 组织间隙; 显微镜检查; 共焦; 磁共振成像
中图分类号:R445.2 文献标志码:A 文章编号:1671-167X(2018)02-0221-05
Application of anoptomagnetic probe Gd-DO3A-EA-FITC in imaging and analyzing the brain interstitial space
LI Yun-qian1,2,3, SHENG Hui1,2,3, LIANG Lei1, ZHAO Yue2,3, LI Huai-ye2,3, BAI Ning2,3,4, WAN Tong1,2,3, YUAN Lan1,△, HAN Hong-bin3,△
1. Department of Chemical Biology, Peking University School of Pharmaceutical Sciences, Beijng 100191, China
2. Peking University Medical and Health Analysis Center, Beijng 100191, China
3. Beijing Key Lab of Magnetic Resonance Imaging Device and Technique, Beijing 100191, China
4. Jinzhou Medical University of Pharmaceutical Sciences, Jinzhou 121000, Liaoning, China
5. Department of Radiology, Peking University Third Hospital, Beijing 100191, China
△ Corresponding author’s e-mail, yuan_lan@bjmu.edu.cn, hanhongbin@bjmu.edu.cn
Fund:Supported by the National Key Research and Development Plan (2016YFC0103605, 2016YFC0103602, 2016YFC0103600), the National Natural Science Foundation of China (91330103, 91630314, 81471633), the National Science Fund for Distinguished Young Scholars (61625102), the Beijing Municipal Science and Technology (Z161100000116041), and the Peking University Seed Fund for Medicine-Engineering Interdisciplinary Research Project (BMU20120290)
Abstract
Objective:To investigate the application of the optical magnetic bimodal molecular probe Gd-DO3A-ethylthiouret-fluorescein isothiocyanate (Gd-DO3A-EA-FITC) in brain tissue imaging and brain interstitial space (ISS).Methods:In the study, 24 male SD rats were randomly divided into 3 groups, including magnetic probe group ( n=6), optical probe group ( n=6) and optical magnetic bimodal probe group ( n=12), then the optical magnetic bimodal probe group was divided equally into magnetic probe subgroup ( n=6) and optical probe subgroup ( n=6). Referencing the brain stereotaxic atlas, the coronal globus pallidus as center level, the probes including gadolinium-diethylene triamine pentaacetic acid (Gd-DTPA), fluorescein isothiocyanate (FITC) and Gd-DO3A-EA-FITC of 2 μL (10 mmol/L) were injected into the caudate nucleus respectively, magnetic resonance imaging (MRI) was performed in the magnetic probe group and magnetic probe subgroup to image the dynamic diffusion and distribution of the probes in the brain ISS, a self-developed brain ISS image processing system was used to measure the diffusion coefficient, clearance, volume fraction and half-time in these two groups. Laser scanning confocal microscope (LSCM) was performed in vitro in the optical probe group and optical probe subgroup for fluorescence imaging at the time points 2 hours after the injection of the probe, and the distribution in the oblique sagittal slice was compared with the result of the first two groups.Results:For the magnetic probe group and magnetic probe subgroup, there were the same imaging results between the probes of Gd-DTPA and Gd-DO3A-EA-FITC. The diffusion parameters of Gd-DTPA and Gd-DO3A-EA-FITC were as follows: the average diffusion coefficients [(3.31±0.11)×10-4 mm2/s vs. (3.37±0.15)×10-4 mm2/s, t=0.942, P=0.360], the clearance [(3.04±0.37) mmol/L vs. (2.90±0.51) mmol/L, t=0.640, P=0.531], the volume fractions (17.18%±0.14% vs. 17.31%±0.15%, t=1.961, P=0.068), the half-time [(86.58±3.31) min vs. (84.61±2.38) min, t=1.412, P=0.177], the diffusion areas [(23.25±0.68) mm2 vs. (22.71±1.00) mm2, t=1.100, P=0.297]. The statistical analysis of each brain was made by t test, and the diffusion parameters were not statistically significant. Moreover, for the optical probe group and optical probe subgroup, the diffusion area of Gd-DO3A-EA-FITC [(22.61±1.16) mm2] was slightly larger than that of FITC [(22.10±1.29) mm2], the statistical analysis of each brain was made by t test, and the diffusion parameters were not statistically significant ( t=0.713, P=0.492).Conclusion:Gd-DO3A-EA-FITC shows the same imaging results as the traditional GD-DTPA, and it can be used in measuring brain ISS.
Key words: Brain; Contrast media; Molecular probe techniques; Interstitial space; Microscopy; confocal; Magnetic resonance imaging

磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)是一种非常有潜力的组织成像方法, 能够实现在体观察组织深部的特征。本课题组以往的研究中, 我们发现采用磁示踪法可以检测脑深部广阔区域的脑组织间隙(interstitial space, ISS), 实现在体、实时、全脑尺度的对脑组织间液 (interstitial fluid, ISF) 流动的监测[1, 2]。磁示踪法利用射频信号监测, 可3D动态观察ISF的流动, 并同时检测ISS中水分子的扩散参数[3], 是目前唯一一种可以实现对活体脑ISS进行三维可视化成像的技术[4]。但是, 这种方法的分辨率低, 有时无法精确显示示踪剂分布的范围。

20世纪90年代, 美国纽约大学的Charles Nicholson教授等采用电化学法和光学示踪法作为脑组织间隙的检测手段[5]。电化学法主要依靠电位变化检测电信号, 只能探测相距< 200 μ m间隙的生理参数[5], 而具有高分辨率的显微光学示踪法是利用光学信号, 由于光的穿透能力有限, 因此只能探测距离脑浅表< 200 μ m区域内组织间液分子的扩散运动[6], 且只能在离体状态下进行脑深部成像, 然而光学方法的分辨率高、成像清晰, 可弥补MRI方法分辨率相对较低这一缺陷。

本课题组自2008年开始应用光磁两种方法对ISS进行测定并相互验证, 从而实现较为精确、完整地测定ISS的信息[7]。为了进一步研究ISS中物质运输的基本规律, 在前期研究基础上, 本研究将光学探针与磁示踪探针相结合, 制备出光磁双模态分子探针Gd-DO3A-ethylthiourea-fluorescein isothiocyanate (Gd-DO3A-EA-FITC)[8], 应用磁示踪法和荧光示踪法实时动态监测ISS中物质运输的基本规律, 并与传统磁示踪剂钆-二乙三胺五乙酸(gadolinium-die-thylene triamine pentaacetic acid, Gd-DTPA)、光示踪剂异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)在ISS中的扩散分布进行比较, 对光磁双功能模拟探针进行生物学评价, 探讨其在未来的科学研究及临床应用中的重要意义。

1 材料与方法
1.1 实验动物

本实验获得北京大学生物医学伦理委员会实验动物福利伦理分会审查批准(批准文号:LA201460)。实验选用适龄雄性SPF级SD大鼠24只, 体重200~250 g。随机分为磁示踪组(6只)、荧光示踪组(6只)和光磁示踪组(12只), 光磁示踪组再随机分为磁示踪亚组(6只)和荧光示踪亚组(6只)。

1.2 实验仪器

激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope, LSCM) (TCS SP8 MP, 徕卡公司, 德国), 由北京大学医药卫生分析中心提供, 3.0 T磁共振成像仪(Magnetom Trio, 西门子公司, 德国)由北京大学第三医院提供, 鼠脑立体定位仪和鼠脑模具购自深圳瑞沃德公司。

1.3 示踪剂在鼠脑中的扩散

将实验大鼠腹腔麻醉后放入MRI中进行预扫描。备皮, 剪开皮肤, 逐层分离皮下筋膜和软组织, 剥离骨膜, 暴露颅骨表面, 标记前囟位置。将大鼠固定于立体定位仪上, 为维持大鼠的生理体温, 可将大鼠放置在加热毯上。以前囟为中心, 定位尾状核的颅骨表面位置(前囟点前0.5 mm, 右2.5 mm, 深6 mm), 以记号笔标记。按照记号笔标记位点, 用手术刀片在颅骨表面钻孔。采用微量注射泵以0.2 μ L/min的速度向注射位点自动注入10 mmoL的Gd-DTPA、FITC和Gd-DO3A-EA-FITC溶液2 μ L, 留针5 min防止回流。MRI进行连续3D T1W1 MP-RAGE序列扫描, 扫描序列的参数为回波时间(echo time, TE) 3.7 ms, 重复时间(repetition time, TR) 1 500 ms, 翻转角(flip angle, FA) 9° , 视野(field of view, FOV) 267 mm, 矩阵(Matrix) 512× 512, 体素(Vo-xel) 0.5 mm× 0.5 mm× 0.5 mm, 带宽(brand width) 300 Hz/Px, 激发次数(NEX: average) 2, 扫描时间(time of acquiration, TA) 290 s。荧光示踪组和荧光示踪亚组在注射2 h后灌流取脑, 放置在4%(体积分数)多聚甲醛溶液中固定, 将固定好的鼠脑放在鼠脑模具中, 斜矢状位切片, 每片厚约2 mm, LSCM检测。

1.4 数据处理与分析

利用自主研发的脑ISS图像处理系统[3]完成Gd-DTPA和Gd-DO3A-EA-FITC在SD大鼠尾状核的扩散参数的测定。利用SPSS 20.0软件完成统计学分析。扩散系数、清除率、体积分数和半衰期及扩散分布最大面积等参数使用 x̅± s的形式进行描述。Gd-DTPA和Gd-DO3A-EA-FITC在SD大鼠尾状核的扩散参数采用t检验(双侧检验)完成。取α =0.05, 即P< 0.05时为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 Gd-DTPA与Gd-DO3A-EA-FITC在鼠脑尾状核中扩散参数的比较

应用MRI可获得不同时间点磁示踪剂在鼠脑尾状核中的扩散图像, 图1和图2分别显示的是Gd-DTPA与Gd-DO3A-EA-FITC在鼠脑尾状核中不同切面的扩散图像。在尾状核区域, Gd-DTPA与Gd-DO3A-EA-FITC的扩散系数分别为(3.31± 0.11)× 10-4 mm2/s、(3.37± 0.15)× 10-4mm2/s (t=0.942, P=0.360), 清除率分别为(3.04± 0.37) mmol/L、(2.90± 0.51) mmol/L (t=0.640, P=0.531), 体积分数分别为17.18%± 0.14%、17.31%± 0.15% (t=1.961, P=0.068), 半衰期分别为(86.58± 3.31) min、(84.61± 2.38) min (t=1.412, P=0.177), 扩散分布最大面积分别为(22.71± 1.00) mm2、(23.25± 0.68) mm2(t=1.100, P=0.297), 两者间各项扩散参数差异均无统计学意义(表1)。

图1 Gd-DTPA在鼠脑尾状核区域的扩散分布Figure 1 Diffusion distribution of Gd-DTPA in rat caudate nucleus
A, sagittal views over time before and after injection of Gd-DTPA; B, axial views over time before and after injection of Gd-DTPA; C, coronal views over time before and after injection of Gd-DTPA.

图2 Gd-DO3A-EA-FITC在鼠脑尾状核区域的扩散分布Figure 2 Diffusion distribution of Gd-DO3A-EA-FITC in rat caudate nucleus
A, sagittal views over time before and after injection of Gd-DO3A-EA-FITC; B, axial views over time before and after injection of Gd-DO3A-EA-FITC; C, coronal views over time before and after injection of Gd-DO3A-EA-FITC.

表1 Gd-DTPA与Gd-DO3A-EA-FITC在鼠脑尾状核中扩散参数的比较 Table 1 Diffusion parameters of Gd-DTPA and Gd-DO3A-EA-FITC in rat caudate nucleus
2.2 FITC与Gd-DO3A-EA-FITC在鼠脑尾状核中的荧光成像

与磁示踪相比, 光磁示踪组不仅能够进行MRI成像, 同时也能采集荧光图像。图3显示的是鼠脑斜矢状位的荧光图像, 示踪剂主要分布在尾状核区域, FITC和Gd-DO3A-EA-FITC在鼠脑内扩散分布面积分别为(22.10± 1.29) mm2、(22.61± 1.16) mm2, 两者的扩散面积差异无统计学意义(t=0.713, P=0.492), 但Gd-DO3A-EA-FITC的扩散面积略大于FITC。

图3 FITC和Gd-DO3A-EA-FITC在鼠脑尾状核中的荧光成像Figure 3 Fluorescent images of Gd-DTPA and Gd-DO3A-EA-FITC in rat caudate nucleus
A, fluorescent images; B, reflected light images; C, the overlay picture of fluorescent images and reflected light images.

3 讨论

本研究结果表明, Gd-DO3A-EA-FITC是一种光磁双敏感的探针, 可作为MRI的造影剂和光学成像的荧光探针[9]。在脑组织成像中, 应用MRI测定Gd-DO3A-EA-FITC与Gd-DTPA在脑深部的扩散, 其结果没有显著差异, 同时可通过光学成像, 离体观察Gd-DO3A-EA-FITC在脑深部的扩散, 实现ISS的光磁双重同步检测, 实现检测结果的相互验证。

ISS中的物质运输是机体一种重要的生理功能, 随着近年来研究的不断深入, 其结构和功能特征也受到了广泛的关注。实现对ISS进行在体、准确的观察, 对于该领域的研究具有重要的意义[10]。扩散和团流是ISS内的物质转运的基本方式[11]。在之前的研究中, 我们采用单一模态的示踪剂来监测ISS, 例如采用单一的磁示踪剂Gd-DTPA来探测脑深部的结构。Gd-DTPA是目前临床上最常用的阳性对比增强剂[12, 13], 与其他示踪剂相比, Gd-DTPA具有生物惰性、热稳定性、分子量较小以及细胞外分布的优点[14, 15], 在其周围2.5 Å (1 Å =0.1 nm)的有效范围内可以通过缩短氢质子自旋-晶格弛豫时间来追踪内源性水分子, 从而在MRI成像上出现高信号。在安全剂量范围内的Gd-DTPA对脑实质不会产生损害, 且不会造成MRI图像失真和变形[16], 因此, 本研究采用Gd-DTPA作为磁示踪剂对ISS进行在体实时的测定。但是, 相比光学成像方法, MRI分辨率较低, 为弥补这一缺陷, 我们同时采用荧光示踪剂FITC来探测脑浅部区域的结构。

FITC作为一种荧光示踪剂, 常被用于细胞检测, 由于其对细胞的毒性小, 因而被用于ISS的光学探针。但由于光的透过度有限, 因此光学成像只能检测脑浅表区域, 随着双光子技术的发展, 尽管能够逐渐增加光学成像探测的深度, 但目前仍难以利用光学成像探测脑深部区域。在我们前期的研究中, 以琼脂糖凝胶为多孔介质, 模拟荧光示踪剂FITC和磁示踪剂Gd-DTPA在体外的扩散规律, 发现这两种示踪剂在琼脂糖凝胶中主要表现为各向同性扩散运动, 且随时间的延长, 其扩散面积基本一致。磁示踪法在三维结构成像上具有极强的优势, 而荧光示踪法在分子水平成像具有分辨率高等优点, 因此, 我们在研究ISS时, 荧光示踪法与磁示踪法的测量结果可以相互佐证[17]。

我们对ISS进行检测时, 经常使用同一浓度、同一剂量的荧光示踪剂FITC和磁示踪剂Gd-DTPA, 分别应用光学成像和磁示踪法进行对比检测, 能够从在体和离体两方面说明ISS的分区引流特点, 但由于这两种示踪剂没有偶联在一起, 在对比验证ISS的时候存在一定的局限性, 因此, 我们根据Mishra等[8]的方法合成光磁双模态分子探针Gd-DO3A-EA-FITC, 并对其合成方法进一步改进, 从而得到纯度高、溶解度好、荧光信号和磁信号等各种理化性质均稳定的光磁双模态分子探针, 且该探针与Gd-DTPA在分子量和极性等性质上相近。

将双模态探针Gd-DO3A-EA-FITC注入鼠脑后, 通过在体的MRI和离体的LSCM, 同步验证了前期研究中发现的ISS分区引流特征。Gd-DO3A-EA-FITC不仅能够表现出磁示踪特性, 显示活体脑深部的组织间隙结构特征, 还能够表现出荧光特性, 显示在离体状态下示踪剂的分布情况, 其优势主要有以下几点:(1)能够通过离体、活体双重检测, 精准定位细胞生物组织; (2)在ISS的研究中, 能够清晰表明ISS内的组织液流动机制以及ISS与细胞及细胞外基质的关系; (3)为疾病的诊断和治疗提供了物质基础。

LSCM是生物医学领域中最为先进的显微光学成像技术之一, 具备三维重建、Merging等功能, 在检测生物样品时具有实时、分辨力高的优势, 被称为细胞水平的“ CT” , 广泛应用于分子跟踪检测的研究中[18, 19, 20]。MRI可以实现活体检测, 完成全脑尺度的三维立体成像, 而LSCM在离体组织、微观成像方面又具有分辨率高等其他检测手段难以替代的优势, 弥补了MRI分辨率低的缺陷, 能够清晰、准确地观察到不同脑区ISS微观结构的差异, 为脑组织的研究提供了进一步的证据。随着双光子技术的不断发展, 光学探测深度的增加, 光磁双功能模态探针在未来可进行光学的活体脑深部成像, 并与MRI成像进行相互印证, 为之后全脑组织的精确研究奠定基础。

The authors have declared that no competing interests exist.

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