引用本文
白宁, 杨凌飞, 安丽华, 王雯, 李昀倩, 盛荟, 王彤, 李华侃, 袁兰. 精神分裂症模型鼠腹腔中的中性粒细胞趋化运动的动态可视化分析. 北京大学学报(医学版), 2018,50(2): 226-230
BAI Ning, YANG Ling-fei, AN Li-hua, WANG wen, LI Yun-qian, SHENG Hui, WANG Tong, LI Hua-kan, YUAN Lan. Dynamic visual analysis of neutrophils chemotaxis in peritoneal cavity of schizo-phrenic model in mice. Journal of Peking University(Health Sciences), 2018,50(2): 226-230.  
Doi: 10.3969/j.issn.1671-167X.2018.02.005
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精神分裂症模型鼠腹腔中的中性粒细胞趋化运动的动态可视化分析
白宁1,2, 杨凌飞2,3, 安丽华2, 王雯2, 李昀倩2,3, 盛荟2,3, 王彤2,3, 李华侃4,△, 袁兰2,3,△
1.锦州医科大学药学院, 辽宁锦州 121000
2. 北京大学医药卫生分析中心, 北京 100191
3.北京大学药学院化学生物学系, 北京 100191
4.锦州医科大学公共基础学院, 辽宁锦州 121000
收稿日期: 2017-12-06
资助项目: 国家重点研发计划(2016YFC0103605、2016YFC0103602、2016YFC0103600)、国家自然科学基金(91330103、91630314、81471633)、国家杰出青年基金(61625102)、北京市科技计划(Z16100000116041)资助
摘要
目的:应用细胞动态可视化系统观察并分析正常鼠和精神分裂症模型鼠腹腔中的中性粒细胞趋化运动能力及其差异。方法:18只健康昆明小鼠随机分为对照组(6只)、0.3 mg/kg 5-甲基二氢二苯并环庚烯亚氨马来酸(dizocilpine maleate,MK-801)处理组(6只)、0.6 mg/kg MK-801处理组(6只),分别提取中性粒细胞,在显微镜下观察形态并计数。将每组细胞分成两份进行趋化实验,分别为趋化剂处理组和趋化剂未处理组,即对照组 1、0.3 mg/kg MK-801处理组1、0.6 mg/kg MK-801处理组 1和对照组 2、0.3 mg/kg MK-801处理组 2、0.6 mg/kg MK-801处理组 2。使用NIS-Elements软件记录细胞动态迁移过程。使用TAXIScan Analyzer 2软件每组细胞随机选取30个细胞(即 n=30)分析细胞迁移的轨迹、速度和距离,并采用配对检验和单因素方差分析进行统计学分析。结果:对照组、0.3 mg/kg MK-801处理组、0.6 mg/kg MK-801处理组的中性粒细胞的数量分别是(1.00±0.03)×104/mL、(0.05±0.02)×104/mL、(0.32±0.01)×104/mL,差异均有统计学意义( P<0.05)。在趋化剂的作用下,对照组1、0.3 mg/kg MK-801处理组1、0.6 mg/kg MK-801处理组1的中性粒细胞定向迁移能力分别是(0.85±0.11) radian、(1.00±0.11) radian、(0.96±0.10) radian,差异均有统计学意义( P<0.05);中性粒细胞迁移速度分别是(0.09±0.02) μm/s、(0.12±0.01) μm/s、(0.14±0.01) μm/s,差异均有统计学意义( P<0.05);中性粒细胞迁移距离分别是(94.26±0.02) μm、(134.61±0.01) μm、(156.19±0.01) μm,差异均有统计学意义( P<0.05)。结论:与对照组腹腔中的中性粒细胞比较,精神分裂症模型鼠腹腔中的中性粒细胞具有更强的趋化运动能力。
关键词: 精神分裂症; 中性粒细胞; 细胞趋化运动
中图分类号:R122.1+1 文献标志码:A 文章编号:1671-167X(2018)02-0226-05
Dynamic visual analysis of neutrophils chemotaxis in peritoneal cavity of schizo-phrenic model in mice
BAI Ning1,2, YANG Ling-fei2,3, AN Li-hua2, WANG wen2, LI Yun-qian2,3, SHENG Hui2,3, WANG Tong2,3, LI Hua-kan4,△, YUAN Lan2,3,△
1.Department of Pharmceutical,Jinzhou Medical University, Jinzhou 121000, Liaoning, China
2.Peking University Me-dical and Health Analysis Center,Beijing 100191,China
3.Department of Chemical Biology,Peking University School of Parmaceutical Sciences,Beijing 100191,China
4.Department of Basic Science, Jinzhou Medical University, Jinzhou 121000, Liaoning, China
△ Corresponding author’s e-mail, lihuakan@163.com, yuan_lan@bjmu.edu.cn
Fund:Supported by the National Key Research and Development Plan(2016YFC0103605, 2016YFC0103602, 2016YFC0103600), The National Natural Science Foundation of China (91330103, 91630314, 81471633), The National Outstanding Youth Foundation of China(61625102)and the Beijing Science and Technology Plan (Z161100000116041)
Abstract
Objective:To compare the differences of neutrophils chemotaxis ability in peritoneal cavity between normal rats and schizopherenic rats with cell dynamic visualization system.Methods:In the study,18 healthy Kunming rats were randomly divided into 3 groups which were control group( n=6), 0.3 mg/kg MK-801 treatment group( n=6), 0.6 mg/kg dizocilpine maleate (MK-801) treatment group( n=6), extracted neutrophils separately, and observed the morphology and counted under a microscope. Each group of cells was divided into two parts for chemotactic experiment, called chemokine agent treatment group and no chemokine agent treatment group respectively, indicating control 1,0.3 mg/kg MK-801 treatment 1,0.6 mg/kg MK-801 treatment 1 and control 2,0.3 mg/kg MK-801 treatment 2,0.6 mg/kg MK-801 treatment 2.The dynamic migration of cells was recorded using the NIS-Elements software, and TAXIScan Analyzer 2 software was used to select 30 cells ( n=30) in each group of cells and analyze cells migration trajectory, speed and distance, and use pair test and One-Way analysis of variance for statistical analysis.Results:The number of neutrophils in control group, 0.3 mg/kg MK-801 treatment group and 0.6 mg/kg MK-801 treatment group were(1.00±0.03)×104/mL,(0.05±0.02)×104/mL,(0.32±0.01)×104/mL respectively, the differences of results were statistically significant( P<0.05).Under the effect of chemotactic agent,the directional migration capability of neutrophils in control group 1, 0.3 mg/kg MK-801 treatment group 1 and 0.6 mg/kg MK-801 treatment group 1 were(0.85±0.11) radian,(1.00±0.11) radian,(0.96±0.10) radian respectively ( P<0.05); the migration velocities of neutrophils were (0.09±0.02) μm/s,(0.12±0.01) μm/s,(0.14±0.01) μm/s respectively ( P<0.05);the migration distances of neutrophils were (94.26±0.02) μm,(134.61±0.01) μm,(156.19±0.01) μm respectively( P<0.05).Conclusion:Compared with neutrophils in peritoneal cavity of control group, the neutrophils in peritoneal cavity of schizophrenic rats have stronger chemotactic movement ability.
Key words: Schizophrenia; Neutrophil; Cell chemotaxis

精神分裂症(schizophrenia, SZ)是一种重症型精神疾病, 有文献报道我国约有700 万人患有精神分裂症[1], 患者本身存在一定的语言、行为、思维以及心理等障碍, 不能进行正常的工作和生活, 对家庭和社会都会造成一定的负担。炎症免疫过程已被证明在精神分裂症的病因以及病理学方面有着重要的影响[1]。目前, 精神分裂症免疫功能的研究相对较少, 但精神分裂症患者本身存在免疫功能异常是毋庸置疑的[2]。中性粒细胞是免疫系统的重要组成部分, 同时又是机体天然免疫的第一道防线, 具有趋化、吞噬以及杀菌的作用[3]。研究精神分裂症模型鼠腹腔中的中性粒细胞趋化功能的变化, 将有助于研究致病机制及疾病的治疗。

基于谷氨酸功能紊乱的假说, 用5-甲基二氢二苯并环庚烯亚氨马来酸(dizocilpine maleate, MK-801)造模产生的精神分裂症模型鼠是研究精神分裂症很好的工具[4, 5], 采用细胞动态可视化系统观察和分析中性粒细胞趋化迁移的轨迹和速度[6], 将为临床研究精神分裂症机制和探讨治疗方案提供一定的实验数据和方法学参考。

1 资料与方法
1.1 仪器与材料

细胞动态可视化系统(Fluorescent Cell Mobility Analysis Device, 尼康公司, 日本)由北京大学医药卫生分析中心提供, 18只清洁级昆明小鼠购自北京大学医学部实验动物科学部, 巯基乙酸盐肉汤购自美国FLUKA公司, MK-801购自美国Abcom公司, 趋化剂色氨酸-赖氨酸-酪氨酸-蛋氨酸-缬氨酸-天门冬氨酸-蛋氨酸(Trp-Lys-Tyr-Met-Val-Asp-Met, WKYMVm)购自美国Abcom公司。

1.2 精神分裂症模型鼠的建立

基于精神分裂症谷氨酸功能紊乱的假说, 用N-甲基-D-天门冬氨酸非竞争性抑制剂MK-801作用于实验小鼠, 使用剂量为0.3 mg/kg和0.6 mg/kg, 分别对小鼠造模, 建立精神分裂症动物模型[7, 8, 9, 10]。

1.3 腹腔中性粒细胞的提取

用蒸馏水配制巯基乙酸盐肉汤, 115 ℃高压灭菌30 min, 肉汤放置室温分装, 4 ℃保存。小鼠腹腔注射1 mL巯基乙酸肉汤, 4 h后对其进行腹腔麻醉, 待小鼠麻醉后, 经腹膜注射1 mL无菌磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS), 1 min后抽提。腹腔提取中性粒细胞后, 在显微镜下进行细胞计数。500× g离心5 min[11], 用PBS重悬沉淀, 重复离心3次进行细胞纯化, 用0.5 mL无血清培养基重悬细胞沉淀, 用于趋化实验。之后使用Hoechest 33342标记提取的细胞, 验证此细胞是中性粒细胞[12]。

1.4 小鼠实验分组和细胞趋化实验分组

18只健康的昆明小鼠随机分为对照组、0.3 mg/kg MK-801处理组、0.6 mg/kg MK-801处理组, 按照第1.3小节步骤分别提取中性粒细胞, 将每组细胞分成两份进行趋化实验, 即对照组1和对照组2、0.3 mg/kg MK-801处理组1和0.3 mg/kg MK-801处理组 2、0.6 mg/kg MK-801处理组 1和0.6 mg/kg MK-801处理组2, 对照组 1、0.3 mg/kg MK-801处理组 1和0.6 mg/kg MK-801处理组 1加入趋化剂作为趋化剂处理组, 而对照组 2、0.3 mg/kg MK-801处理组 2和0.6 mg/kg MK-801处理组 2不加入趋化剂作为趋化剂未处理组。

1.5 中性粒细胞的趋化实验

用细胞动态可视化系统的NIS-Elements软件记录中性粒细胞的趋化迁移过程。将制备好的中性粒细胞(1× 106/mL)1 μ L依次加入TAXIScan芯片下方孔内, 再将趋化剂WKYMVm(1 μ mol/L)2 μ L依次加入芯片上方孔内。实验条件:10倍物镜, 采用自动对焦模式, 拍摄时间间隔15 s, 动态影像拍摄时间1 h。用TAXIScan Analyzer 2软件处理动态可视化影像数据, 每组中性粒细胞随机选取30个细胞(即n=30)分析细胞迁移的方向、速度及距离。

1.6 统计学分析

采用SPSS 20.0软件完成, 进行配对检验和单因素方差分析, 组内的两两比较、多组间的两两比较采用t检验(双样本异方差假设), P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 精神分裂症模型鼠的表现

对照组小鼠未表现出精神分裂症的症状, 0.3 mg/kg MK-801处理组和0.6 mg/kg MK-801处理组均诱发出类似精神分裂症的症状, 即呆板、单调、转圈和非自主的刻板性动作。从药物起效应的时间来看, 0.3 mg/kg MK-801处理组给药后约10 min诱发出类似精神分裂症的症状, 而0.6 mg/kg MK-801处理组起效时间在5 min左右。从药物剂量方面来看, 剂量越高, 症状维持时间越长。

2.2 提取的中性粒细胞的形态和数量

Hoechest 33342标记细胞核, 呈现蓝色荧光, 可见细胞核呈弯曲杆状或2~3分叶状, 类似于马蹄形(图1), 证实小鼠腹腔提取的细胞均为中性粒细胞。

图1 腹腔提取的中性粒细胞激光扫描共聚焦显微镜图像Figure 1 Laser scanning confocal microscope images of neutrophils extracted from the peritoneal cavity
A, fluorescence image; B, light microscope image; C, the overlay picture of fluorescence image and Light microscope image. Red arrow shows the nucleus of neutrophils.

如图2显示对照组和两个处理组的细胞数量, 对照组细胞数量最多, 处理组细胞数量明显减少。对照组与0.3 mg/kg MK-801处理组比较、对照组与 0.6 mg/kg MK-801处理组、0.3 mg/kg MK-801处理组与0.6 mg/kg MK-801处理组比较差异均有统计学意义(P< 0.05)。

图2 腹腔提取的中性粒细胞数量的变化Figure 2 Changes in the number of neutrophils extracted from the peritoneal cavity
C, control group; 0.3 mg/kg-T, 0.3 mg/kg MK-801 treatment group; 0.6 mg/kg-T, 0.6 mg/kg MK-801 treatment group.* P< 0.05.

2.3 中性粒细胞的趋化实验

2.3.1 中性粒细胞迁移的TAXIScan图像 从拍摄的细胞动态可视化影像中分别截取0、30、60 min时间点的中性粒细胞迁移TAXIScan图像(图3), 可以清晰地观测到, 无论对照组还是MK-801处理组, 在趋化剂WKYMVm的作用下, 排列在芯片观察通道一侧的大多数中性粒细胞均能向通道对侧进行较快的定向迁移, 可见细胞群体的前端随时间不断向前推进, 见图3 的对照组1、0.3 mg/kg MK-801处理组 1和0.6 mg/kg MK-801处理组 1, 而趋化剂未处理组, 只有少量细胞发生随机迁移, 细胞运动较慢, 30 min和60 min通道内观测到的细胞数量变化不大, 见图3 的对照组2、0.3 mg/kg MK-801处理组 2和 0.6 mg/kg MK-801处理组 2。

图3 中性粒细胞迁移的TAXIScan图像(红色箭头指示的方向是细胞运动的方向)Figure 3 TAXIScan imaging of neutrophils migration(red arrow shows the direction of the cell movement)
C1(control 1), 0.3 mg/kg-T1(0.3 mg/kg MK-801 treatment 1)and 0.6 mg/kg-T1(0.6 mg/kg MK-801 treatment 1) represent the chemotactic agent treatment group; C2(control 2), 0.3 mg/kg-T2(0.3 mg/kg MK-801 treatment 2)and 0.6 mg/kg-T2(0.6 mg/kg MK-801 treatment 2) represent the no chemotactic agent treatment group.

2.3.2 中性粒细胞迁移轨迹的分析 对照组和MK-801处理组的中性粒细胞迁移方向的分析见图4。在趋化剂的作用下, 中性粒细胞具有较强的定向趋化迁移能力, 而未加入趋化剂组, 细胞做无定向运动, 差异有统计学意义。另外, 对照组1与0.3 mg/kg MK-801处理组1组比较、对照组1与0.6 mg/kg MK-801处理组1组比较, 差异均有统计学意义。

图4 中性粒细胞迁移方向的分析Figure 4 Analysis of the migration direction of neutrophils
C1(control 1), 0.3 mg/kg-T1(0.3 mg/kg MK-801 treatment 1)and 0.6 mg/kg-T1(0.6 mg/kg MK-801 treatment 1) represents the chemotactic agent treatment group; C2(control 2), 0.3 mg/kg-T2(0.3 mg/kg MK-801 treatment 2) and 0.6 mg/kg-T2(0.6 mg/kg MK-801 teatment 2) represents the no chemotactic agent treatment group.radian is the unit of the direction, represents the angle between instantaneous direction and level of neutrophils. radian is 1, which represents a corresponding angle of about 60° , radian is 1.5, which represents a corresponding angle of about 90° .A, effect of chemokine on the migration direction of neutrophils in control group(n=30); B, effect of chemokine on the migration direction of neutrophils in 0.3 mg/kg-treatment group(n=30); C, effect of chemokine on the migration direction of neutrophils in 0.6 mg/kg MK-801 treatment group(n=30); D, migration direction of neutrophils was compared in control group and treatment group(n=30). * P< 0.05.

2.3.3 中性粒细胞迁移速度和距离的分析 对照组和MK-801处理组的中性粒细胞趋化迁移速度的分析见图5A、5B及5C, 在趋化剂的作用下, 细胞运动较快; 而未加入趋化剂组, 细胞运动较慢, 差异有统计学意义。

图5 中性粒细胞趋化迁移速度和距离的比较Figure 5 Comparison of the migration velocity and distance of neutrophils
C1(control 1), 0.3 mg/kg-T1(0.3 mg/kg MK-801 treatment 1)and 0.6 mg/kg-T1(0.6 mg/kg MK-801 treatment 1) represents the chemotactic agent treatment group; C2(control 2), 0.3 mg/kg-T2(0.3 mg/kg MK-801 treatment 2) and 0.6 mg/kg-T2(0.6 mg/kg MK-801 treatment 2) represents the no chemotactic agent treatment group.A, effect of chemokine on the migration velocity of neutrophils in control group(n=30); B, effect of chemokine on the migration velocity of neutrophils in 0.3 mg/kg MK-801 treatment group(n=30); C, effect of chemokine on the migration velocity of neutrophils in 0.6 mg/kg MK-801 treatment group(n=30); D, migration velocity of neutrophils was compared in control group and treatment group(n=30); E, comparison of the migration path of neutrophils under the action of chemokin(n=30).* P< 0.05.

中性粒细胞趋化迁移速度的分析见图5D, 对照组1与0.3 mg/kg MK-801处理组1比较、对照组1

与0.6 mg/kg MK-801处理组1比较均差异有统计学意义。对照组和MK-801处理组的中性粒细胞在趋化剂的作用下迁移路程的分析见图5E, 对照组1与0.3 mg/kg MK-801处理组1比较、对照组1与0.6 mg/kg MK-801处理组1比较均差异有统计学意义。

3 讨论

基于谷氨酸功能紊乱的假说, 使用MK-801作用于昆明小鼠, 可产生类似精神分裂症的症状, 即呆板、单调、转圈和非自主的刻板性动作。本研究结果表明, 与对照组比较, 精神分裂症模型鼠腹腔的中性粒细胞具有更强的趋化迁移能力、趋化方向性更强、迁移速度更快、距离更长。从药物起效应的时间来看, 0.3 mg/kg MK-801处理组给药后约10 min诱发出类似精神分裂症的症状, 而0.6 mg/kg MK-801处理组起效时间在5 min左右。从药物剂量方面来看, 剂量越高, 症状维持时间越长, 这一研究结果与文献报道[7, 8]基本吻合。

昆明小鼠腹腔提取的中性粒细胞, 经过在显微镜下细胞计数后, 与对照组细胞数量比较, 发现在模型鼠腹腔中抽提的中性粒细胞数量明显减少, 推测这可能与精神分裂症多发炎症反应有关, 在病情发作期间, 中性粒细胞可以从血液中渗出, 快速募集到发病的炎症反应位点, 进行趋化、杀菌以及吞噬等活动[3, 14, 15], 这样在腹腔中难以募集到足够数量的中性粒细胞。

本文采用新颖的细胞动态可视化系统记录中性粒细胞的踪迹[15, 16, 17], 与传统的Transwell实验和细胞划痕实验相比, 细胞动态可视化系统具有以下优点:(1)实验用细胞数量少, 最少可小于100个细胞, 使用较少数量的细胞可实现对大数量细胞的统计和分析; (2)细胞整齐的排列在芯片一侧, 向芯片另一侧进行水平迁移, 可排除重力的影响, 细胞迁移距离可达260 μ m, 便于观察和分析细胞的趋化行为; (3)可以自动计数细胞数量随时间的变化, 操作简便, 准确度高, 可以实现任意时间点的细胞数检测。

本研究结果将有助于探讨精神分裂症的致病机制及治疗, 同时也为探究疾病模型中各种血细胞的运动功能及机制建立了新的技术方法。相信随着显微成像技术的不断快速发展, 有关精神分裂症的细胞运动机制的研究将会更为直观、准确、清晰地呈现。

The authors have declared that no competing interests exist.

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