脂肪组织取自3例北京大学第一医院尿道狭窄手术患者, 用于提取ASCs行原代细胞培养; 外周血取自健康志愿者, 用于分离人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)。本研究经北京大学第一医院临床研究伦理委员会批准(2017[420])。

1.2.1 清洗 取皮下脂肪约10 mL, 预热磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline, PBS)至37 ℃, 用长镊将脂肪转移至PBS中, 摇晃后静置1 min, 用移液管吸弃下层液体, 再倒入适量(50~100 mL)PBS, 反复清洗至颜色变清(约3~5次)。

1.2.2 消化 将脂肪转移至培养皿中, 把明显的血管和电刀灼伤组织剔除, 初步将脂肪剪小, 再加入2 mL胶原酶消化液(美国Gibco), 用剪刀快速剪碎后转移至50 mL离心管中, 补加等体积胶原酶消化液, 放入37 ℃摇床消化, 75 r/min消化1 h, 每5~10 min上下颠倒混匀。

1.2.3 离心 消化完成后, 1 300 r/min离心3 min(后续离心所用参数相同), 取出剧烈摇动10 s, 再次离心, 小心吸弃上层脂肪组织和消化液, 加入培养基至10 mL, 重悬沉淀转移至15 mL离心管中, 离心, 小心吸弃上层液体, 用培养基再次洗涤后离心弃上清, 用培养基重悬沉淀, 移入培养皿。48 h后换液。第3~5代细胞用于后续实验。

1.3.1 成脂分化及油红O染色 脂肪干细胞在成脂培养基中培养2周。成脂培养基成分:DMEM培养基、10%(体积分数)胎牛血清、1 μ mol/L地塞米松、10 μ mol/L胰岛素、200 μ mol/L吲哚美辛及0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(3-isobutyl-1-methyl-xanthine, IBMX)。油红O染色验证成脂分化能力:细胞室温下用40 g/L多聚甲醛固定1 h, 用70%(体积分数)乙醇漂洗, 室温下用油红O试剂(北京索莱宝公司)孵育3~5 min, 再用去离子水漂洗3遍, 苏木素复染核。

1.3.2 成骨分化及Von Kossa染色 利用商品化成骨分化培养基(美国Gibco)诱导ASCs向成骨细胞分化。诱导3周后, 用Von Kossa染色验证成骨分化能力:细胞在室温下用40 g/L多聚甲醛固定1 h, 去离子水漂洗3遍, 用Von Kossa染液(北京雷根)在紫外光照射下染色10 min。

加入3 mL Ficoll-paque plus(美国GE)于15 mL离心管管底, 倾斜离心管, 小心贴壁加入4 mL全血于上层。室温400× g离心30 min, 加减速度均设置为0。小心抽取中间层细胞, 加入3倍体积的PBS清洗, 100× g离心10 min, 此时加减速设置恢复正常。6 mL PBS再次清洗, 离心。弃上清, 用3 mL Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培养基重悬后, 铺于6 cm培养皿中。

采用多种细胞因子混合的方法模拟炎症环境, 各细胞因子在培养基中的浓度如下:IFN-α 10 μ g/L、IFN-γ 50 μ g/L、TNF-α 50 μ g/L、IL-1β 25 μ g/L(均购于北京达科为公司), 用含上述因子培养基培养过夜后, 进行后续实验。

取5× 10⁵个外周血单个核细胞, 用PBS补足至1 mL。加入0.2 μ L CFSE储存液(美国Life), 使得CFSE的终浓度为1 μ mol/L。混匀, 37 ℃避光孵育20 min, 期间每隔5 min上下颠倒混匀, 使染色均匀。加入5 mL完全培养基, 37 ℃ 5 min。离心, 弃上清, 加入200 μ L完全培养基, 加入96孔板孔中培养或流式检测。

ASCs消化后计数, 以1× 10⁴个细胞/孔接种于96孔板中。待24 h后ASCs贴壁, 配置含丝裂霉素C的培养基(丝裂霉素C终浓度为10 mg/L), 换用该培养基培养2 h后, 用PBS清洗5遍。正常组ASCs用正常完全培养基培养(DMEM培养基+10%胎牛血清), 炎症因子组换用含有炎症因子的完全培养基培养。12 h后两组细胞均弃去培养基, 并加入CFSE标记过的PBMCs, 细胞数为1× 10⁵个。培养基含有CD3/CD28抗体(北京同立海源公司)及IL-2, 可刺激T细胞增殖。培养3 d后流式细胞仪检测PBMCs的增殖情况。

使用统计软件SPSS 20.0用于数据分析, 计量资料用均数± 标准差表示, 两独立样本采用Student’ s t检验, P< 0.05被认为差异有统计学意义。

培养至第3代的ASCs被用于本研究。ASCs为贴壁生长, 在倒置光学显微镜下观察为梭形细胞, 细胞密集时可呈鱼群样生长(图1A)。在特定培养基的诱导培养下, 细胞具有向脂肪组织和骨组织分化的能力。Von Kossa染色证实, 在成骨培养基诱导3周后, 细胞内部有钙盐沉积, 提示ASCs具有成骨分化能力(图1B)。油红O染色证实, 用成脂培养基诱导2周后细胞内有脂滴形成, 提示ASCs还具有成脂分化的能力(图1C)。另外, 流式细胞检测结果显示ASCs表面间质组织的一些标志物阳性表达, 如CD44、CD73、CD90和CD105, 阳性率超过90%; 而造血细胞相关标志物, 如CD31和CD45为阴性表达, 阳性率小于2%(图2)。这些结果与国际脂肪治疗联盟(International Federation for Adipose Theraputics, IFATS)关于ASCs表面分子表型的说明一致。

图1

Figure 1

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	图1 ASCs的分化Figure 1 Differentiation of ASCs A, human ASCs at passage 3 were spindle shaped when cultured in normal completed medium; B, Von Kossa staining showed deposition of calcium salts (black) after 3 weeks in osteogenic differentiation medium; C, oil-O staining showed the formation of lipid droplet (orange) after 2 weeks in adipogenic differentiation medium.

图2

Figure 2

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	图2 ASCs表面的CD分子表达情况Figure 2 CD molecules expression file of ASCs CD, cluster of differentiation. ASCs were negative for CD31 and CD45 while they were positive for CD44, CD73, CD90 and CD105. Blue line indicated the isotype control.

为验证ASCs在体外具有免疫抑制能力, 本研究将ASCs与PBMCs共培养, 用CD3/CD28刺激单个核细胞增殖3 d后, 发现与不加入ASCs相比, 与ASCs共培养组的PBMCs母代细胞的比例升高, 但升高并不明显(ASCs组30.9%± 6.4% vs. 无ASCs组28.4%± 8.9%, P> 0.05), 说明ASCs体外有能够抑制PBMCs增殖的趋势。考虑其在发挥免疫抑制能力时周围环境实际上是处于炎症激活状态的, 为探索在炎症条件下ASCs的免疫抑制作用会发生何种改变, 本研究将ASCs用炎症因子(IFN-α 、IFN-γ 、TNF-α 、IL-1β )处理后再与PBMCs共培养, 发现与不加入ASCs相比, PBMCs母代细胞的比例有明显提高(炎症因子处理后ASCs组38.7%± 10.0% vs. 无ASCs组28.4%± 8.9%, P< 0.05), 提示ASCs经炎症因子处理后能明显抑制PBMCs的增殖(图3)。

图3

Figure 3

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图3 不同处理组PBMCs在CD3/CD28刺激后的增殖情况Figure 3 The proliferation of PBMCs in different groups after CD3/CD28 stimulation ASCs, adipose derived stem cells. A, flowcytometry showed PBMCs had multiple discrete peaks (blue). When cocultured with ASCs (green) or cytokine treated ASCs (red), PBMCs had less discrete peaks. B, the histogram showed the percentage of parental cells of PBMCs in different groups. * P< 0.05.