以2012年9月至2014年3月就诊北京大学第一医院, 经病理诊断为PPGL的患者为研究对象。经北京大学第一医院生物医学研究伦理委员会审查批准(2012[492])并取得患者知情同意后, 留取患者外周静脉血, 提取外周血白细胞DNA。

共入选12例PPGL患者(表1), 包括男性8例、女性4例, 起病年龄12~82岁。其中10例为单发嗜铬细胞瘤; 1例为双侧嗜铬细胞瘤伴MTC(患者P07), 临床诊断为MEN2A, 其父有MTC病史; 1例为多次复发的盆腔副神经节瘤。1例嗜铬细胞瘤(患者P12)和1例副神经节瘤(患者P09)为恶性肿瘤, 其余患者暂未发现转移灶, 无恶性证据。除前述患者P07外均无PPGL或肿瘤综合征家族史。

采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增RET基因的第10、11、13、14、15、16外显子^[5], VHL基因的全部3个外显子, SDHD基因的全部4个外显子, SDHB基因的全部8个外显子, 及上述外显子的邻近内含子(± 20 bp)。PCR扩增产物由北京天一辉远生物科技有限公司进行测序, 并与野生型序列进行比对分析。对临床诊断MEN2A且有家族史的P07患者, 我们取得其共29名家族成员知情同意后采集了该家族的病史, 并筛查了RET基因变异情况。

入选患者中有3例(P06、P07、P12)检出致病性变异, 占全部的25%, 其中2例为RET基因变异, 1例为SDHB基因变异(表2)。

P06患者检出RET基因c.2071G> A(p.G691S)变异和c.2712C> G(p.S904S)变异(图1)。该患者为女性, 无PPGL或其他肿瘤家族史, 发作性血压升高症状出现于43岁, 45岁时发现右肾上腺直径约4.5 cm占位, 术后病理诊断嗜铬细胞瘤。超声检查于甲状腺及甲状旁腺区未见占位。

P07患者检出RET基因c.1901G> A(p.C634Y)变异(图2), 同时检出了RET基因c.2071G> A(p.G691S)和c.2712C> G(p.S904S)变异。患者为男性, 发作性血压升高出现于25岁, 27岁时发现双侧肾上腺占位, 左侧7.46 cm× 4.95 cm, 右侧6.08 cm× 3.21 cm; 甲状腺超声提示双侧甲状腺占位; 降钙素> 900 ng/L。术后病理诊断嗜铬细胞瘤及MTC, 结合基因检测诊断为MEN2A。患者父亲亦患MTC, 提示患者父系可能为一个MEN2A家系。我们对该家系共29名亲属进行了基因筛查和临床病史采集(图3), 筛查中先证者1名叔父确诊为MTC, 共发现5名亲属(Ⅱ 5、Ⅱ 7、Ⅱ 9、Ⅲ 10、Ⅳ 1)存在C634Y变异和G691S/S904S变异, 证实该家系为MEN2A家系。此外, 与该家族无血缘关系、无临床表现的Ⅱ 14亦携带G691S/S904S变异。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 患者一般情况 Table 1 General condition of patients Patient ID Age/years Gender Type of tumors Malignancy Family history P01 45 Male PCC No None P02 39 Female PCC No None P03 82 Male PCC No None P04 28 Male PCC No None P05 12 Male PCC No None P06 45 Female PCC No None P07 27 Male PCC No MTC P08 45 Female PCC No None P09 18 Male Pelvic PGL Yes None P10 49 Female PCC No None P11 45 Male PCC No None P12 46 Male PCC Yes None PCC, pheochromocytoma; PGL, paraganglioma; MTC, medullary thyroid carcinoma.

表1 患者一般情况 Table 1 General condition of patients

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 基因检测结果 Table 2 Result of the gene testing Patient ID Gene Exon Variation P06 RET 11 c.2071G> A (p.G691S) 15 c.2712C> G (p.S904S) P07 RET 11 c.1901G> A (p.C634Y) 11 c.2071G> A (p.G691S) 15 c.2712C> G (p.S904S) P12 SDHB 2 c.136C> T (p. R46X)

表2 基因检测结果 Table 2 Result of the gene testing

P12患者检出SDHB基因c.136C> T变异(图4), 该变异使第46位密码子CGA改变为终止密码子UGA(p.R46X), 为无义突变。该患者为男性, 无PPGL家族史, 42岁出现高血压, 药物控制不良, 44岁起出现发作性血压升高症状。45岁时运动后出现心功能不全, 影像学检查发现右肾上腺约12.3 cm× 12.2 cm巨大占位; 超声心动图提示心肌病变、左心增大, 左心室射血分数(Teich法)33%, 临床诊断儿茶酚胺心肌病可能; ¹³¹I-间碘苄胍(metaiodobenzylguanidine, MIBG)显像示右肾上腺部位不规则巨大异常放射性浓聚区。手术切除右肾上腺区15 cm× 11 cm× 10 cm肿物及肿物粘连部分右肾, 病理诊断为恶性嗜铬细胞瘤。

P05为先天性单心室合并嗜铬细胞瘤患者。患者出生后确诊为先天性单心室畸形, 12岁时发现嗜铬细胞瘤。本研究中未发现该患者SDHD、SDHB、VHL、RET遗传基因致病性变异。

图1

Figure 1

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	图1 患者P06 RET基因变异情况Figure 1 Variation of the RET gene of patient P06 A, c.2071G> A variation in the RET gene of patient P06; B, c.2071 in wildtype RET gene; C, c.2712C> G variation in the RET gene of patient P06; D, c.2712 in wildtype RET gene.

图2

Figure 2

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	图2 患者P07 RET基因变异情况Figure 2 Variation of the RET gene of patient P07 A, c.1901G> A variation in the RET gene of patient P07; B, c.1901 in wildtype RET gene; C, c.2071G> A variation in the RET gene of patient P07; D, c.2712C> G variation in the RET gene of patient P07.

图3

Figure 3

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	图3 患者P07家系图Figure 3 Pedigree of patient P07

图4

Figure 4

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	图4 P12患者SDHB基因变异情况Figure 4 Variation of the SDHB gene of patient P12 A, c.136C> T mutation in the SDHB gene of patient P12; B, c.136 in wildtype SDHB gene.

本研究入选的12例PPGL患者中3例检出了遗传基因致病或可能致病的变异, 占总数的25%, 如除去临床有家族性MEN2A表现的P07, 则在散发表现的患者中有18%发现遗传基因变异。Neumann等^[6]在德国和波兰的271例散发性嗜铬细胞瘤患者中进行的筛查提示, 约24%患者有遗传背景; Waldmann等^[3]对德国36例嗜铬细胞瘤患者进行研究, 其中有13例(36%)发现致病性变异, 包括10例临床确诊为MEN2的患者, 如仅统计临床散发表现的患者, 则存在致病性变异的比例为11.5%。本研究限于规模和时间, 入选病例较少, 无法与上述类似研究进行统计学比较, 但研究结果仍显示我国PPGL患者中存在遗传背景的比例值得重视, 开展遗传基因筛查具有重要临床意义。

本研究在P12患者的SDHB基因发现了c.136C> T(p.R46X)变异, 是一个已证实的致病性变异, 此前国内曾有2例报道^{[12, 13]}。该患者临床表现为右肾上腺恶性嗜铬细胞瘤, ¹³¹I-MIBG显像未发现多灶性表现, 临床未发现副神经节瘤。Neumann等^[7] 对32例SDHB缺陷基因携带者的研究显示, 该类患者约34%存在恶性PPGL, 显著多于SDHD缺陷基因携带者及非SDHB/SDHD基因缺陷相关PPGL患者。Benn等^[8]对SDHB基因缺陷家系的研究显示, 49例患者中22%为恶性肿瘤患者。Dhir等^[14]在60例PPGL中发现11例SDHB基因缺陷, 均为恶性肿瘤患者。上述研究均提示, SDHB基因缺陷患者出现恶性肿瘤比例较高, P12患者的临床表现与此结论相符。Benn等^[8]认为SDHB基因缺陷导致PPGL的外显率较低, 但Jochmanova等^[15]近期的研究提示, R46X变异较其他常见SDHB致病性变异具有较早的起病时间(外显率达50%的年龄为38岁), 因此, 在PPGL患者中筛查SDHB变异情况对判断预后等具有较大意义。

P07患者的RET基因C634Y变异是一个已证实的MEN2A致病性变异, 证实了患者的临床诊断。对该家系成员的RET基因检查、降钙素测定及临床随访发现了先证者及其父之外的1例MTC患者, 确定了先证者之外的5例RET基因C634Y变异携带者。国内外研究显示绝大多数MEN2A患者致病性基因变异位于第634位密码子上^{[16, 17, 18, 19, 20]}, 本研究亦印证了这一结论。除先证者合并双侧嗜铬细胞瘤外, 该家系中主要临床表现均为MTC, 而早期发现和治疗MTC对于改善预后至关重要。美国甲状腺协会在指南中建议必要时对MEN2高危致病性变异携带者施行预防性甲状腺切除术^[5], 相关国内研究亦支持必要的预防性手术^[21], 故开展PPGL患者的RET基因检测, 对于潜在的MEN2患者诊治具有重要意义。

P07患者亦存在RET基因的c.2071G> A(p.G691S)/c.2712C> G(p.S904S)变异(以下简称G691S/S904S), 其母(图3中Ⅱ 6)未发现该变异, 而家系中其他C634Y携带者均存在G691S/S904S, 提示P07患者的C634Y和G691S/S904S均来自于父亲, 两者有连锁关系。P06患者也发现了RET基因的G691S/S904S变异, 未发现其他致病性变异, 其临床表现为单侧嗜铬细胞瘤, 无甲状腺肿瘤, 无家族史。G691S/S904S变异的高度连锁性已由Gil等^[16]报道, 且被多个其他研究证实, 但该变异与MEN2的关系尚未明确。Siqueira等^[17]的研究发现, G691S/S904S在MEN2患者中出现的频率与健康人群中无明显差异, 提示该变异可能无法单独导致MEN2, 但G691S/S904S可能在MEN2起病过程中有调节作用。同时存在G691S/S904S和某些其他RET基因单核苷酸多样性(如c.2307T> G, p.L769L或c.2508C> T, p.S836S)或G691S/S904S纯合子的MEN2患者, 都表现出MTC和嗜铬细胞瘤起病更早的倾向^{[17, 22]}。P07患者确诊年龄较早(27岁), 但此趋势尚需进一步证实。对该家系的随访可能有助于进一步了解G691S/S904S对MEN2A临床表现的影响。在G691S/S904S对MTC的致病作用方面, Figlioli等^[23]的研究认为该变异对MTC无明显致病效应, 而Lantieri等^[24]则认为其致病效应不高于一个隐性致病基因, 推测该效应可能是通过G691S产生的, 但目前尚无研究显示G691S/S904S对PPGL的致病作用。结合上述研究结果, 我们推测G691S/S904S可能不会导致PPGL, 或其致病效应较弱, 因而在小规模研究中无法明确, 更大规模的研究数据可能有助于明确这一推测。

本研究发现1例先天性单心室合并嗜铬细胞瘤患者(P05), 查阅文献, 国外曾有5例单心室合并嗜铬细胞瘤的报道^{[25, 26, 27, 28]}, 但国内尚未见类似病例报道。单心室畸形为罕见病, 而该病与另一罕见病PPGL的合并可能提示了两者之间的联系。阿部等^[27]结合PPGL的低氧机制假说, 提出单心室畸形导致长期的右向左分流, 使体循环动脉血氧饱和度下降, 组织长期处于低氧状态, 导致低氧反应通路持续激活, 可能促使了肿瘤的形成。根据此假说, 患者可能不存在SDHD、SDHB胚系基因致病性变异, 而存在因长期低氧产生的肿瘤体细胞基因改变。本研究在P05患者遗传基因中未发现SDHD、SDHB基因的胚系致病性变异, 符合上述推论, 但进一步验证该假说需要对肿瘤体细胞相关基因变异、表达的情况进行研究。

综上所述, 本研究在25%(3/12)PPGL的患者中发现了致病性或可能致病的遗传基因变异。1例恶性嗜铬细胞瘤患者存在SDHB基因c.136C> T, p.R46X无义突变; 1个MEN2A家系存在RET基因c.1901G> A, C634Y变异以及该基因的G691S/S904S变异; 1例单发嗜铬细胞瘤、暂无恶性表现的患者存在RET基因G691S/S904S变异。尽管本研究入选病例数较少, 但研究结果仍表明上述变异可能存在致PPGL作用, 显示出基因筛查对PPGL患者的重要性以及家族疾病监测的意义, 应在PPGL患者中广泛开展基因筛查工作。

(本文编辑:赵 波)