引用本文
袁蒙蒙, 王锰, 刘俊义, 张志丽. 基于4-氨基-5-甲酰基-8,10-二去氮杂四氢叶酸二乙酯侧链的水解反应条件优化. 北京大学学报(医学版), 2017,49(4): 714-718
YUAN Meng-meng, WANG Meng, LIU Jun-yi, ZHANG Zhi-li. Optimization of alkaline hydrolysis based on the side chain of diethyl ester 4-amino-N5 -formyl-N8,N10 -dideazatetrahydrofolic acid . Journal of Peking University(Health Sciences), 2017,49(4): 714-718.  
Doi: 10.3969/j.issn.1671-167X.2017.04.030
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基于4-氨基-5-甲酰基-8,10-二去氮杂四氢叶酸二乙酯侧链的水解反应条件优化
袁蒙蒙1, 王锰1, 刘俊义1,2, 张志丽1,△
1. 北京大学药学院化学生物学系, 北京 100191
2. 北京大学天然药物与仿生药物国家重点实验室, 北京 100191
收稿日期: 2015-09-14
资助项目: 国家自然科学基金(21172014)资助
摘要

目的:改进经典抗叶酸类药物关键中间体4-氨基-5-甲酰基-8,10-二去氮杂四氢叶酸二乙酯侧链的水解条件。方法:以经典叶酸拮抗剂侧链N-(4-氨基苯甲酰)- L-谷氨酸二乙酯(1)为反应原料,尝试了氢氧化钠(NaOH)和氢氧化钾(KOH)2种碱催化、20~180 min 5种反应时间和0.175~1 mol/L 3种碱浓度的反应条件,用高效液相色谱法检测目标产物和副产物,最终确定副产物为单酯水解产物以及酰胺键水解产物,并以此为依据完成了4-氨基-5-甲酰基-8,10-二去氮杂四氢叶酸二乙酯(5)水解条件的优化。结果:改进后的4-氨基-5-甲酰基-8,10-二去氮杂四氢叶酸二乙酯侧链的水解条件为0.3 mol/L KOH溶液中室温条件反应60 min,在该反应条件下,水解反应收率为95.6%。反应产物通过磁共振氢谱(1H nuclear magnetic resonance,1H NMR)、磁共振碳谱(13C nuclear magnetic resonance,13C NMR)和电喷雾飞行时间质谱(electrospray ionization time of flight mass spectrometry,ESI-MS)分析鉴定后结构正确,并通过高效液相色谱法确定其纯度为96%。新的水解反应条件避免了副产物的生成,提高了反应收率。结论:利用新的水解条件可以简便、高效地完成4-氨基-5-甲酰基-8,10-二去氮杂四氢叶酸二乙酯的水解反应,该条件对经典叶酸拮抗剂的合成和生产工艺的改进也有重要的意义。

关键词: 叶酸拮抗剂; 叶酸二乙酯类似物; 水解反应
中图分类号:R917 文献标志码:A 文章编号:1671-167X(2017)04-0714-05
Optimization of alkaline hydrolysis based on the side chain of diethyl ester 4-amino-N5 -formyl-N8,N10 -dideazatetrahydrofolic acid
YUAN Meng-meng1, WANG Meng1, LIU Jun-yi1,2, ZHANG Zhi-li1,△
1. Department of Chemical Biology,Peking University School of Pharmaceutical Sciences, Beijing 100191, China
2. Peking University State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs, Beijing 100191, China
△ Corresponding author’s e-mail,lilybmu@bjmu.edu.cn
Fund:Supported by the National Natural Science Foundation of China(21172014)
Abstract

Objective:To optimize and establish the best hydrolysis method of diethyl ester 4-amino-N5-formyl-N8,N10-dideazatetrahydrofolate through the optimization of simple compound of diethyl N-(4-aminobenzoyl)- L-glutamate.Methods:To increase the low yield of hydrolysis reaction of diethyl ester 4-amino-N5-formyl-N8,N10-dideazatetrahydrofolate due to the by-products and difficult purification, we studied the effect of NaOH and KOH, two kinds of alkalis, three concentrations between 0.175-1 mol/L and five types of reaction time involved in 20, 30, 60, 120 and 180 min on the common side chain diethyl N-(4-aminobenzoyl)- L-glutamate. A high performance liquid chromatography was established for measuring the target product and the by-products in reaction liquid in different reaction conditions. Finally, on the basis of the best hydrolysis method of diethyl ester 4-amino-N5-formyl-N8,N10-dideazatetrahydrofolate, we completed the optimization of the hydrolysis reaction conditions of diethyl ester 4-amino-N5-formyl-N8,N10-dideazatetrahydrofolate.Results:We developed the best reaction condition for the hydrolysis of diethyl ester 4-amino-N5-formyl-N8,N10-dideazatetrahydrofolate, which could be carried out easily and efficiently. The results indicated that treated with the optimized condition of 0.3 mol/L KOH in 60 min at the room temperature, diethyl ester 4-amino-N5-formyl-N8,N10-dideazatetrahydrofolate was converted into its diacid derivative in 95.6 % yield, which turned to be a better reaction condition compared with the previous reaction condition. The structures of those compounds were identified to be correct by1H nuclear magnetic resonance(1H NMR),13C nuclear magnetic resonance(13C NMR) and electrospray ionization time of flight mass spectrometry (ESI-MS). The purity of the diacid derivative of the compound was determined to be 96% by high performance liquid chromatography(HPLC).The new hydrolysis reaction condition could not only avoid the formation of single ester hydrolysis product and amide bond hydrolysis product, but also improve the yield of the hydrolysis reaction.Conclusion:We have developed an efficient reaction for the hydrolysis of diethyl ester 4-amino-N5-formyl-N8,N10-dideazatetrahydro. Since the final step of the synthesis of classical folic acid antagonists is always the catalyzed hydrolysis of the side chain glutamate, the reaction also has great significance for anti-folic acid anti-tumor inhibitors synthesis.

Key words: Antifolate; Folic acid diethylester derivatives; Hydrolysis reaction

叶酸代谢作为肿瘤化疗药的优秀靶点, 从氨甲蝶呤(methotrexate , MTX)作为二氢叶酸还原酶抑制剂在临床应用以来, 相继有多种叶酸拮抗剂问世, 已成为临床肿瘤化疗的重要手段[1, 2]。经典叶酸拮抗剂抗肿瘤药的化学结构与叶酸相似, 均含有对氨基苯甲酰谷氨酸侧链或类似结构, 此结构被叶酰多聚γ -谷氨酸合成酶(folypoly glutamatesynthase, FPGS)识别和谷氨酰化, 再通过叶酸还原转运系统(reduced folate carrier, RFC)运输到细胞内部, 发挥抗肿瘤作用[3]。

根据叶酸代谢酶底物的结构特点和构效关系, 本课题组设计合成了一系列含有对氨基苯甲酰谷氨酸侧链的4-氨基-8, 10-二去氮杂-5-取代基经典叶酸类化合物, 研究结果显示, 该类化合物具有显著的肿瘤抑制活性, 其中化合物4-氨基-5-甲酰基-8, 10-二去氮杂四氢叶酸(5)[半抑制浓度= (0.73± 0.31) μ mol/L]具有明显的抗HL-60细胞活性[4], 并具有较好的安全性和药代动力学性质, 目前正在进行临床前研究, 但是在大量合成过程中发现, 最后一步反应, 即对氨基谷氨酸二乙酯侧链水解为相应二乙酸(6)的收率比较低(40%~60%), 纯度也仅为70%~80%。其他含芳甲酰谷氨酸侧链的抗肿瘤药, 如甲氨喋呤[5](methotrexate, MTX)、雷替曲塞[6](raltitrexed)、培美曲塞[7](pemetrexed)和洛美曲索[8](lometrexol), 最后一步同样为乙酯基水解反应, 总结其方法基本为, 在0.25~2 mol/L NaOH碱溶液中常温搅拌3~72 h, 反应收率仅为40%~70%, 因此本研究以侧链对氨基苯甲酰谷氨酸二乙酯为研究对象, 以高效液相色谱法( high performance liquid chromatography, HPLC)为研究手段, 寻求4-氨基-5-甲酰基-8, 10-二去氮杂四氢叶酸二乙酯合适的碱水解条件, 同时也为上述类似侧链结构的抗肿瘤药的合成方法提供改进依据。

1 材料与方法

磁共振氢谱(1H nuclear magnetic resonance, 1H NMR)和磁共振碳谱(13C nuclear magnetic resonance, 13C NMR)用瑞士Bruker公司的 AVANCE Ⅲ -400型磁共振仪测定; 熔点用中国上海双旭电子有限公司X4型显微熔点仪测定; 电喷雾飞行时间质谱(electrospray ionization time of flight mass spectro-metry, ESI-MS)用美国Waters公司的Quattro Micro 2000型仪器测定; 高效液相色谱仪用美国 Agilent公司的Agilent 1260测定; JB-3型定时恒温磁力搅拌器购自上海雷磁新泾仪器有限公司; 4-氨基-5-甲酰基-8, 10-二去氮杂四氢叶酸二乙酯由本实验室提供, 纯度98%, 所用试剂为国产或进口化学纯试剂。

1.1 高效液相色谱条件

色谱柱为Agilent Extend-C18 Column [4.6 mm(内径)× 150 mm(长度), 3.5 μ m(填料粒径)], 流动相为水 ∶ 甲醇(60 ∶ 40, V/V), 柱温30 ℃, 流速:1.0 mL/min, 检测波长254 nm, 进样量20 μ L。

1.2 碱类型、碱浓度及反应时间对N-(4-氨基苯甲酰)-L-谷氨酸二乙酯(1)水解反应的影响

以简单化合物N-(4-氨基苯甲酰)-L-谷氨酸二乙酯(1)为原料, 分别考察碱类型、碱浓度及反应时间对水解反应生成目标产物N-(4-氨基苯甲酰)-L-谷氨酸二乙酸(2)、酰胺键断裂生成对氨基苯甲酸(3)和不完全水解生成单乙酯谷氨酸(4)的影响, 具体水解反应见图1, 并应用优化后的水解条件考察含有此侧链的化合物4-氨基-5-甲酰基-8, 10-二去氮杂四氢叶酸二乙酯的水解情况。

图1 N-(4-氨基苯甲酰)-L-谷氨酸二乙酯的水解反应Figure 1 Hydrolysis reaction of diethyl N-(4-aminobenzoyl)-L-glutamate

1.2.1 KOH条件下反应时间对N-(4-氨基苯甲酰)-L-谷氨酸二乙酯(1)水解反应的影响 50 mg (0.162 mmol)化合物1溶于1.6 mL 的KOH(0.3 mol/L)水溶液中常温反应, 在30、60、120、180 min 时, HPLC测定反应液中目标产物2、副产物3和4以及剩余原料1的含量。

1.2.2 NaOH条件下反应时间对N-(4-氨基苯甲酰)-L-谷氨酸二乙酯(1)水解反应的影响 50 mg(0.162 mmol)化合物1溶于1.6 mL的NaOH(0.3 mol/L)水溶液中常温反应, 在30、60、120、180 min时, HPLC检测反应液中主产物2、副产物3和4以及剩余原料1的含量。

1.2.3 不同浓度KOH条件下N-(4-氨基苯甲酰)-L-谷氨酸二乙酯(1)水解反应杂质种类及含量 选取较好催化结果的KOH, 浓度分别为 0.175 mol/L、0.3 mol/L和1 mol/L, 在60 min时HPLC检测剩余原料1、目标产物2及副产物3和4的含量, 考察浓度对水解反应的影响。

1.3 4-氨基-5-甲酰基-8, 10-二去氮杂四氢叶酸二乙酯(5)的水解反应条件的验证及含量测定 50 mg(0.095 mmol)化合物5溶于1 mL的KOH(0.3 mol/L)水溶液中(图2), 常温搅拌1 h, 滴加HCl(1 mol/L), pH=6, 反应液冷冻干燥, 除去盐, 再次冷冻干燥可得终产物42.44 mg。收率95.6%, 纯度为96%。熔点(melting point, mp):169~170 ℃。1HNMR[400 MHz, 二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)-d6]:δ 1.65(s, 1H, CHaHb-7), 1.77(s, 1H, CHaHb-7), 1.93~1.97(m, 1H, CHaHb-9), 2.05~2.07(m, 2H, CHaHb-9, CHaHbCH2CO), 2.31~2.39(m, 3H, CH2CO, CHaHbCH2CO), 2.47~2.67(m, 2H, CH2-10), 2.77~2.82(m, 2H, CH2-8), 3.01(brs, 1H, NCH-6), 4.34~4.36(m, 1H, NCHCO), 6.01(s, 2H, 2NH2), 7.25~7.30(m, 1H, CONH), 7.33~7.40(m, 2H, C6H4), 7.77~7.82(m, 2H, C6H4), 8.38(s, 1H, CHO); 13CNMR(DMSO-d6, 100 MHz):δ 26.6(C-7), 27.4(C-8), 28.3(CH2CH2CO), 31.1(CH2CH2CO), 31.6(C-10), 36.927(C-9), 50.9(NCHCO), 53.3(C-6), 116.1(C-4a), 127.8(2× Ph), 128.6(2× Ph), 132.4(Ph-CONH), 145.4(PhCH2CH2), 158.1(C-8a), 159.1(C-4), 161.7(C-2), 163.1(NCHO), 166.3(CONH), 175.0(CHCOO), 175.1(CH2COO); ESI-MS:[M+H]+ m/z: 471.2。

图2 4-氨基-5-甲酰基-8, 10-二去氮杂四氢叶酸二乙酯的水解反应Figure 2 Hydrolysis reaction of diethyl ester 4-amino-N5 -formyl-N8, N10-dideazatetrahydrofolate

2 结果与讨论
2.1 碱类型、碱浓度及反应时间对化合物N-(4-氨基苯甲酰)-L-谷氨酸二乙酯(1)水解反应的影响

2.1.1 KOH条件下反应时间对化合物1水解反应的影响 由表1可知, 反应时间30 min时, 尽管已经有酰胺键水解产物3的产生, 但原料1有剩余, 还有部分单酯水解产物4。反应时间超过60 min时, 虽然原料1和单水解产物不存在, 反应比较完全, 但是酰胺键水解产物3增加, 因此60 min为宜, 水解产物含量最高为95.6%。

表1 反应时间对水解反应的影响 Table 1 Effect of reaction time on the hydrolysis

2.1.2 NaOH条件下反应时间对化合物1水解反应的影响 由表2可知, 30 min时目标产物2的含量最大为94.9%, 60 min时其含量为91.6%, 与30 min相比变化不大, 但是酰胺键断裂的产物3明显增大。再延长反应时间, 产物2的含量下降, 酰胺键水解产物3增多。因为30 min时2的含量最大, 又考察了20 min的反应情况, 结果目标产物2的含量为 74.5%, 还有11.3%的原料未反应, 因此NaOH溶液条件下最佳反应时间为30 min, 与KOH溶液的反应条件比较, 该反应条件对时间要求比较严格。

表2 反应时间对水解反应的影响 Table 2 Effect of reaction time on the hydrolysis

2.1.3 不同浓度KOH条件下化合物1水解反应杂质种类及含量 从表3中可以看出, 在KOH溶液低浓度为条件下, 反应体系中原料1、目标产物2和单酯水解产物4共存时间长, 推测目标化合物2达到理想含量或收率, 需要相当长的时间。而其浓度为1 mol/L时, 单酯水解产物4以及和酰胺键断裂产物3含量均增加, 因此, 最优反应条件为0.3 mol/L KOH溶液中室温反应60 min。

表3 碱浓度对水解反应的影响 Table 3 Effect of alkaline concentration on the hydrolysis
2.2 4-氨基-5-甲酰基-8, 10-二去氮杂四氢叶酸二乙酯的水解反应条件的验证

将优化后的水解条件, 即0.3 mol/L KOH溶液室温反应60 min, 应用于化合物5的水解反应, 其产物的色谱图见图3A, HPLC监测收率为95.6%, 纯度为 96%, 表明该水解条件适用于化合物5的水解反应。

图3 不同反应条件下4-氨基-5-甲酰基-8, 10-二去氮杂四氢叶酸二乙酯水解的高效液相监测色谱图
A, hydrolysis reaction in 0.3 mol/L KOH for 60 min; B, hydrolysis reaction in 0.3 mol/L NaOH for 120 min; C, hydrolysis reaction in 1 mol/L KOH for 60 min.Figure 3 Chromatograms of diethyl ester 4-amino-N5 -formyl-N8, N10 -dideazatetrahydrofolate hydrolysis reaction in different conditions

本研究也考察了其他水解条件下化合物5的水解情况, 在0.3 mol/L NaOH溶液室温反应120 min时, 化合物5除了两个乙酯基水解外, 部分酰胺键也发生水解反应, 其产物的色谱图见图3B, 在此水解过程中也有此酰胺键水解杂质; 在1 mol/L KOH溶液中室温反应60 min时, 反应液中尚有不完全水解的单乙酯产物, 同时存在酰胺键水解产物, 见色谱图3C。

综上所述, 本研究完成了4-氨基-5-甲酰基-8, 10-二去氮杂四氢叶酸二乙酯侧链水解条件的优化, 考察了不同碱催化、不同反应时间以及不同浓度等条件对目标产物及副产物含量的影响, 优化后的水解条件为0.3 mol/L KOH溶液中室温反应60 min, 收率95.6%, 纯度 96%。由于经典叶酸拮抗类药物合成最后一步均为侧链谷氨酸二乙酯部分的碱催化水解[9], 因此该反应对经典叶酸拮抗剂的合成和生产工艺的改进也有重要的意义。

The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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