母亲服用叶酸营养素补充剂与围产儿死亡率的关系尚未明确。Keats等[5]对20项前瞻性随机对照试验研究进行的荟萃分析表明，母亲孕期服用含叶酸的复合营养素补充剂不影响围产儿死亡率；而Liu等[4]基于中国22万例中国人群前瞻性队列研究表明，妇女围孕期每天摄入400 μg叶酸降低了围产儿死亡的总体风险。母亲围受孕期服用叶酸已被证实可以预防胎儿神经管缺陷[6]。为预防神经管缺陷，2009年6月中国政府启动了“增补叶酸预防神经管缺陷”重大公共卫生项目[7]，向农村户籍备孕妇女免费提供可服用6个月的单纯叶酸片(pure folic acid，FA)，每片含叶酸400 μg，此后，城镇户籍妇女也被纳入该项目。在北京，部分备孕妇女也会自行购买和服用含叶酸的复合营养素片(multiple-micronutrients containing folic acid，MMFA)，我国市场适用于妊娠妇女的MMFA每片含叶酸400~800 μg[8]。北京市的妇幼保健系统记录了每一位在北京市进行孕期保健和分娩妇女的围受孕期服用叶酸营养素补充剂情况和母亲妊娠期与子代孕期至学龄前的健康状况信息。前期，我们基于该系统的研究发现母亲围受孕期服用叶酸营养素补充剂降低了胎儿神经管缺陷[8]、先天性心脏病[9]、腹壁裂畸形[10]、肢体畸形[11]和宫内发育迟缓[12]的发生率。因此，我们设想“增补叶酸预防神经管缺陷”重大公共卫生项目的实施可能进一步降低了围产儿死亡率。为验证这一假设，并为明确母亲服用叶酸营养素补充剂与围产儿死亡率的关系提供新的证据，本研究以2013年1月至2018年12月北京市通州区妇幼保健数据为基础，采用回顾性队列研究方法分析母亲围受孕期服用叶酸营养素补充剂与围产儿死亡率的关系。
1 资料与方法
1.1 研究对象
研究对象为2013年1月至2018年12月在北京市通州区的妇幼保健系统注册登记的妇女所生育的围产儿共95 685例，剔除1 195例围产儿结局或其围受孕期母亲服用营养素情况信息缺失的人群，最终纳入94 490例围产儿。
本研究已获得北京大学生物医学伦理委员会批准(批准号：IRB00001052-18010)。
1.2 数据收集
资料来源于北京市通州区的妇幼保健院的妇幼保健系统，妇女确定怀孕后至孕13周内前往居住地附近的社区医院完成在孕期保健系统注册登记。注册时由经过统一系统培训的社区医生对妇女进行面对面问卷调查，并将数据录入孕期保健系统。问卷调查采集的信息包括：妊娠妇女基本特征：民族、年龄、户籍地、文化程度、职业、孕前体重指数(body mass index，BMI)、末次月经日期、胎数、既往疾病史等；孕前3个月到调查时叶酸营养素补充剂服用情况：是否服用叶酸营养素补充剂(未服用或服用)，服用营养补充剂配方(FA或MMFA)，开始服用时间(孕前或孕后，即在末次月经之前或之后)，服用频率(低频或高频，即10 d内服用1~7 d，或10 d服用8 d及以上)。孕妇分娩孕周、围产儿结局、围产儿死亡原因、围产儿性别和围产儿体重等信息由孕期保健和分娩医院的产科和儿科医生录入妇幼保健系统。通州区妇幼保健院保健科工作人员于每年10月和11月通过电话进行抽样调查，信息核实，评价数据质量。
1.3 指标定义
围产期[13]即妊娠满28周至产后7 d。以每1 000例围产儿中的死胎、死产和产后7 d内新生儿死亡例数为围产儿死亡率，即围产儿死亡率(‰)=(孕28周以上死胎死产数+产后7 d内新生儿死亡数)/(孕28周以上死胎死产数+满28周活产数)× 1 000。
死胎死产原因按《北京市死胎死产报告卡》死因编码分类，新生儿死亡原因按《北京市儿童死亡报告卡》死因编码分类。
1.4 统计学分析
使用频数和百分比描述研究对象的基本特征，应用卡方检验比较不同叶酸营养素补充剂服用情况的母亲之间的基本特征差异。然后，分别以不同的叶酸营养素补充剂服用情况作为自变量，以围产儿是否死亡作为因变量，应用泊松(Poisson)对数线性模型计算相应的粗风险比(crude risk ratio，cRR)及其95%CI。考虑到本研究是回顾性队列研究，研究对象非随机被分配到各暴露组，各组间可能存在潜在混杂因素(如母亲年龄、户籍、种族、文化程度等)的分布不均衡的问题，且围产儿死亡病例数较少，因此，我们在研究中应用倾向性评分逆概率加权法(inverse probability of weights，IPW)对不同叶酸补充组间的研究对象特征变量进行调整，模拟随机化实验，应用Logistic回归模型计算各指标的倾向性评分及权重，并在调整后使用标准化均数差(standardized mean differences，SMD)评估加权后各组间基线特征的均衡性。考虑到2015年以前妇幼保健系统未收集孕前BMI信息，因此，我们拟合了两个多因素泊松对数线性模型，模型1纳入2013年1月至2018年12月数据，调整基线特征包括母亲民族、年龄、文化程度、职业、户籍地、产次、胎数、孕周、是否应用辅助生殖技术和分娩年份；模型2纳入2015年1月至2018年12月数据，在模型1的基础上进一步调整母亲孕前BMI。将调整后的权重系数纳入泊松对数线性模型，计算调整后风险比(adjusted risk ratio，aRR)及其95%CI。
为验证本研究人群叶酸营养素补充剂信息的准确性，我们分析了通州区妇幼保健院分娩的17 054例妇女的孕早期同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)水平与叶酸营养素补充剂服用情况的关系。Hcy检查结果为非正态分布，采用中位数(第25，第75百分位数)描述，组间比较应用Mann-Whitney U检验。
本研究对人群基本特征中缺失值占比在5%以内的指标采用多重插补的方式进行了插补。采用R 4.3.2软件进行统计分析，所有的统计检验均采用双侧检验，检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 研究对象基本特征
围产儿母亲平均年龄为(29.2±4.2)岁，26~30岁占45.4%，孕前平均BMI为(22.3±8.5) kg/m2，文化水平在大专及以上占比为69.5%，一半以上母亲或父亲为外地户籍。
2013年1月至2018年12月间共发生围产儿死亡256例，围产儿死亡率为2.71‰。6年间围产儿死亡率未见趋势性变化(Ptrend＞0.05)。
母亲围受孕期叶酸营养素补充剂服用率为90.4%。在服用者中，44.3%母亲服用FA，55.7%服用MMFA；孕前开始服用的母亲占53.6%；47.2%的母亲高频服用。服用叶酸营养素补充剂组与未服用组比较，民族、年龄、受教育水平、职业、户籍地、孕前BMI、产次、胎数、应用辅助生殖技术、生育年份分布差异存在统计学意义(P＜0.05)。FA组与MMFA组比较，民族、年龄、受教育水平、职业、户籍地、产次、胎数、孕周、应用辅助生殖技术、生育年份分布差异存在统计学意义(P＜0.05)。孕前与孕后服用组比较，低频与高频服用组比较，年龄、受教育水平、职业、户籍地、孕前BMI、产次、胎数、孕周、应用辅助生殖技术、生育年份、出生体重分布差异均存在统计学意义(P＜0.05)，见表 1。
表1 叶酸营养素补充剂不同比对组研究对象基本特征Table 1 Maternal and perinatal characteristics among the comparison groups of FA or MMFA |
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2.2 母亲围受孕期服用叶酸营养素补充剂与围产儿死亡率的关系
如表 2所示，母亲围受孕期服用叶酸营养素补充剂组与未服用组的围产儿死亡率分别为2.63‰和3.43‰，差异无统计学意义(cRR=0.77，95%CI：0.54~1.14；aRR=0.93，95%CI：0.77~1.13)。
表2 母亲围受孕期服用营养补充剂与围产儿死亡率关系Table 2 Association between maternal periconceptional supplementation of FA or MMFA and risk for PMR |
| n | PM, n(‰) | cRR (95%CI) | aRR (95%CI)a | aRR (95%CI)b | |
| FA/MMFA supplementation | |||||
| No use | 9 043 | 31 (3.43) | 1 | 1 | 1 |
| Use | 85 447 | 225 (2.63) | 0.77 (0.54-1.14) | 0.89 (0.75-1.05) | 0.93 (0.77-1.13) |
| Formula of the supplements | |||||
| FA | 37 587 | 84 (2.23) | 1 | 1 | 1 |
| MMFA | 47 166 | 141 (2.99) | 1.34 (1.02-1.76) | 1.29 (1.07-1.56) | 1.31 (1.06-1.62) |
| Initiation time of supplementation | |||||
| No use | 9 043 | 31 (3.43) | 1 | 1 | 1 |
| Post-conception | 39 294 | 112 (2.85) | 0.83 (0.57-1.26) | 0.94 (0.74-1.18) | 0.95 (0.73-1.22) |
| Pre-conception | 45 472 | 113 (2.49) | 0.72 (0.49-1.10) | 0.87 (0.69-1.09) | 0.89 (0.68-1.15) |
| Frequency of supplementation | |||||
| No use | 9 043 | 31 (3.43) | 1 | 1 | 1 |
| 1-7 d/10 d | 44 724 | 126 (2.82) | 0.82 (0.56-1.24) | 0.94 (0.75-1.17) | 0.98 (0.77-1.25) |
| ≥8 d/10 d | 40 052 | 99 (2.47) | 0.72 (0.49-1.10) | 0.84 (0.66-1.07) | 0.84 (0.63-1.11) |
a, adjusted for ethnicity, age, education level, occupation, household registration, parity, numbers of fetuses, gestational age, pregnant with assisted reproductive technology and delivery year; b, adjusted for ethnicity, age, education level, occupation, household registration, parity, numbers of fetuses, gestational age, pregnant with assisted reproductive technology, delivery year and pre-pregnancy BMI. FA, pure folic acid; MMFA, multiple-micronutrients containing folic acid; PM, perinatal mortality; PMR, perinatal mortality rate; cRR, crude risk ratio; aRR, adjusted risk ratio; BMI, body mass index. |
母亲围受孕期服用FA与服用MMFA的围产儿死亡率分别为2.23‰和2.99‰，差异有统计学意义(cRR= 1.34，95%CI：1.02~1.76)，调整潜在混杂因素后，差异仍具有统计学意义(aRR=1.31, 95%CI: 1.06~1.62)；进一步分析叶酸营养素补充剂开始服用时间和服用频率与围产儿死亡的关系，无论是否调整混杂因素，均未发现叶酸营养素补充剂开始服用时间和服用频率与围产儿死亡有关。此外，也未发现围产儿死亡率随着叶酸营养素补充剂服用时间长短和频率高低有趋势性变化(Ptrend＞0.05)。
2.3 母亲围受孕期服用叶酸营养素补充剂和孕早期血浆Hcy浓度的关系
服用叶酸营养素补充剂组孕早期血浆Hcy浓度低于未服用组，MMFA组低于FA组，且孕前开始服用者低于孕后开始者、高频服用者低于低频服用者(P＜0.001)，见表 3。
表3 围受孕期服用叶酸营养素补充剂与孕早期血浆Hcy浓度的关系Table 3 Relationship between maternal periconceptional supplementation of FA or MMFA and plasma Hcy concentration in the first trimester of pregnant period |
| Status of supplementation | n | Hcy/(μmol/L), M (P25, P75) | P |
| FA/MMFA supplementation | ＜0.001 | ||
| No use | 1 427 | 6.5 (5.6, 7.7) | |
| Use | 15 627 | 6.1 (5.3, 7.0) | |
| Formula of the supplements | ＜0.001 | ||
| FA | 5 853 | 6.2 (5.4, 7.2) | |
| MMFA | 9 757 | 6.0 (5.3, 6.9) | |
| Initiation time of supplementation | ＜0.001 | ||
| Pre-conception | 7 500 | 6.0 (5.3, 6.9) | |
| Post-conception | 8 124 | 6.2 (5.4, 7.2) | |
| Frequency of supplementation | ＜0.001 | ||
| 1-7 d/10 d | 8 889 | 6.2 (5.4, 7.2) | |
| ≥8 d/10 d | 6 733 | 6.0 (5.3, 6.9) |
Hcy, homocysteine; FA, pure folic acid; MMFA, multiple-micronutrients containing folic acid. |
3 讨论
本研究结果显示，与围受孕期未补充叶酸的母亲比较，尚未发现服用含叶酸营养素补充剂人群与围产儿死亡率存在关联，这与Lassi等 [18]和Charles等 [19]的研究结果一致，但与Liu等[4]在中国人群开展的一项前瞻性队列研究结果不一致，该研究表明妇女围孕期每天摄入400 μg叶酸降低了围产儿死亡的总体风险，以及降低了体表重大出生缺陷和神经管畸形的风险，尤其是在中国北方，围产期死亡、死胎和早期新生儿死亡估计风险比随着围产期叶酸补充而显著降低。但Liu等[4]的研究数据收集是在中国20世纪90年代，早于本研究20多年，期间中国的经济、医疗卫生条件及人群健康素养水平均显著提高，围产儿保健工作也较前显著提高。此外，该研究围产儿死亡定义为妊娠20周后死胎和7 d内早期新生儿死亡，与本研究围产儿死亡定义不一致。以上可能是导致该研究结论与本研究结论不一致的主要原因。
此外，本研究发现服用MMFA组围产儿死亡率高于服用FA组，这与Liu等[20]在中国开展的双盲随机对照试验和Keats等[5]通过对20项前瞻性随机对照试验研究进行系统性综述所得到的MMFA与FA组围产儿死亡率无差异的结论不一致，原因有：(1)这些随机对照研究多数是观察孕期补充FA和MMFA与围产儿死亡率的关系，大多数开始干预时已经不在胎儿器官发育的关键窗口期，而本研究是围受孕期服用FA与MMFA的比较；(2)妊娠期有些营养素过量，如维生素A[21]或铁[22]，对胚胎发育和母亲健康有不良影响，有可能增加围产儿死亡风险；(3)也可能与本研究是以常规健康监测数据为基础进行的回顾性队列研究，未能全面控制其他潜在混杂因素的干扰有关。
然而本研究也存在一定的局限性：(1)本研究是单中心研究，研究对象仅来自北京市通州区，研究结论仅适用于类似地区的人群。(2)未采集母亲围受孕期通过膳食摄入叶酸和其他营养素的信息，也未收集母亲血浆叶酸浓度的信息。但是，本研究收集了部分母亲孕早期血浆Hcy浓度值。鉴于叶酸与血浆Hcy浓度呈负相关[23]，我们分析了母亲围受孕期服用叶酸营养补充剂与孕早期血浆Hcy浓度关系，发现围受孕期服用叶酸营养素补充剂的母亲孕早期叶酸Hcy浓度显著低于不服用者，服用MMFA的母亲血浆Hcy浓度低于服用FA者，且孕前开始服用者血浆Hcy浓度低于受孕后开始服用者，服用频率高者血浆Hcy浓度低于低频服用者，提示本研究中的围受孕期叶酸营养素补充情况信息较为准确可靠。(3)本研究是以常规健康监测数据为基础进行的回顾性队列研究，难以全面控制潜在混杂因素对研究结果的干扰。
综上所述，本研究尚未发现北京市通州区母亲围受孕期服用叶酸营养素补充剂与围产儿死亡率之间存在关联，围受孕期服用MMFA与围产儿死亡率的关系还需要开展大规模随机对照研究来进一步明确。