血脑屏障对脑内物质的转运具有高度选择性，为大脑提供了稳定的微环境，保护中枢神经系统免受神经毒性物质的侵害[1]。然而，血脑屏障的存在也在很大程度上导致了神经系统疾病科学研究与实际应用之间的差距[2]。因为血脑屏障和全身毒性反应，传统的给药方式(如口服和静脉给药)在许多中枢神经系统疾病的治疗过程中效果不佳，极大限制了药物对中枢神经系统疾病的治疗效果和应用发展[3]。因此，避开血脑屏障治疗中枢神经系统疾病的新兴给药技术得以快速发展，其中，经脑细胞外间隙(extracellular space, ECS)途径给药的对流增强给药(convection enhanced delivery, CED)技术早在2009年便获得美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration, FDA)的批准，并进入临床研究阶段[4-5]。CED的原理主要是将药物通过脑内微导管输送到大脑ECS内，利用正压微量持续输注的方法来维持恒定的压力梯度，促使组织间液发生对流，从而作为渗透作用的补充，加强小分子或大分子蛋白等药物的扩散，使药物以较为恒定的浓度及速率扩散，延长药物在病灶内的作用时间，增加药物的分布区域范围，改善治疗效果。该技术通过ECS途径给药可以绕过血脑屏障的阻碍，使药物直接进入脑组织或病变区域发挥作用[6]。
本课题组前期应用磁示踪探测技术和荧光示踪技术[7]，发现脑ECS内组织间液(interstitial fluid, ISF)呈现分区引流[8]，不同脑ECS分区内ISF的引流速度和途径各不相同[9]，提示药物经脑ECS不同分区给药后可能具有不同的药代动力学特征和规律。但本课题组的前期研究仅局限于脑内，对于药物经脑ECS途径给药后在全身的动态分布和消除路径并未开展相关研究。因此，本研究应用核素示踪成像技术，对经脑ECS途径在不同脑区注入核素示踪剂 99mTc-二乙基三胺五乙酸(99mTc-DTPA)的SD大鼠进行小动物单光子发射型计算机断层扫描/计算机断层扫描(single photon emission computed tomography/computed tomography, SPECT/CT)成像，实时监测示踪剂在脑内及全身的动态分布，进而阐明经脑ECS途径给药后物质的消除规律和不同脑分区的差异。
1 材料与方法
1.1 实验动物
本研究严格按照《中国实验动物使用指南》实施，且通过北京大学生物医学伦理委员会的批准(LA2020221)，实验动物为SD成年大鼠，购自北京大学医学部实验动物科学部，体重180~220 g。
1.2 实验仪器和核素示踪剂
本实验应用的实验仪器包括活体小动物SPECT/CT成像仪(匈牙利/Mediso, Nano SPECT/CT)、全自动γ计数仪(美国Perkin Elmer公司, 1470-002)、鼠脑立体定位仪(美国Stoeling公司)和鼠脑模具(深圳瑞沃德公司)。核素示踪剂 99mTc-DTPA购自原子高科股份有限公司。
1.3 SPECT/CT成像方法
SD大鼠用复合麻醉剂(3 mL/kg)经腹腔麻醉后，对头部进行手术备皮，暴露颅骨，标记前囟点，将大鼠俯卧位固定于鼠脑立体定位仪上，根据《大鼠脑立体定位图谱》，以前囟点为原点，标记目标脑区的位置：尾状核为前1 mm、旁3 mm、深6 mm，丘脑为后3.5 mm、旁3 mm、深6 mm，用手术刀进行颅骨表面钻孔。以微量进样器吸取体积为2 μL、放射性活度约为3.7 MBq (100 μCi)的 99mTc-DTPA(在铅玻璃保护下操作)，以0.2 μL/min的速度注入目标脑区，给药时长为10 min，注射后停针5 min再将针缓慢拔出，避免注入的示踪剂回流。在给药后1、2、3、4 h进行SPECT/CT显像，扫描过程中大鼠俯卧位并固定于大鼠鼠床，使用体积分数为1.6%~2.0%的异氟烷混合纯氧保持大鼠麻醉状态。
SPECT/CT显像参数：低能高分辨率准直器，能峰为114 keV，矩阵256×256。应用Nucline 2.0程序对显像结果进行融合及重建处理。
1.4 生物体内分布实验
按照给药脑区，将SD大鼠随机分成尾状核组和丘脑组。给药操作如上所述，分别在尾状核区和丘脑区注入约3.7 MBq (100 μCi)的 99mTc-DTPA，待其扩散5 h后，取心、肝、脾、左肺、右肺、左肾、右肾、脑(包括嗅球、小脑、左侧大脑、右侧大脑)等重要组织器官，收集尿液、血液，于精密天平仪称重后用全自动γ计数仪测量其放射性计数。
另取4个试管，以相同速率注入约3.7 MBq (100 μCi)的 99mTc-DTPA溶液，与组织同时测定放射性计数作为衰减矫正标准，计算放射性摄取值[每克组织的百分注射剂量率(percentage activity of injection dose per gram of tissue, %ID/g)]，计算公式为：每克组织的百分注射剂量率=选取的组织放射性计数/(注射的药物放射性计数×选取的组织质量)×100%。
1.5 数据处理和统计学分析
数据采用SPSS 27.0软件进行统计学分析，计量资料以平均值±标准差表示，采用独立样本t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 99mTc-DTPA经脑ECS给药后SPECT/CT的成像特点
2.1.1 尾状核区存在“对侧小脑优势引流”
经脑ECS途径在不同脑区给药后，SPECT/CT成像获得的原始图像信号较弱，将所有图像进行同比例放大后观察 99mTc-DTPA在SD大鼠脑内的分布以及在全身的消除路径。尾状核区给药后，SPECT/CT图像显示放射性分布从脑部开始向尾侧扩散，随着时间延长，放射性分布沿着脊柱逐渐积聚在肾和膀胱。示踪剂在尾状核区给药后，先向同侧皮层扩散，同时向头侧和尾侧扩散，随着时间延长，扩散到嗅球、同侧硬膜和对侧小脑，后经脑脊液进入体循环，通过肾和膀胱进行消除(图 1、2)。此外，SPECT/CT图像还显示，左侧尾状核区和右侧尾状核区注入核素示踪剂后，脑内分布存在明显差异：左侧尾状核注入示踪剂，示踪剂随着时间不断扩散到小脑时，会优先向右侧小脑引流(图 1)；右侧尾状核区给药，示踪剂随着时间不断扩散到小脑时，会优先向左侧小脑引流(图 2)。由此可知，经脑ECS途径在尾状核区给药后，药物在脑内的分布和消除路径存在“对侧小脑优势引流”现象。
图1 正常SD大鼠左侧尾状核注射99mTc-DTPA的SPECT/CT图像Figure 1 SPECT/CT images of 99mTc-DTPA injected into the left caudate nucleus of normal SD rats A and C, original drawings; B and D, enlarged view of signal. P, horizontal axis; L, left sagittal; SPECT/CT, single photon emission computed tomography/computed tomography. |
图2 正常SD大鼠右侧尾状核注射99mTc-DTPA的SPECT/CT图像Figure 2 SPECT/CT images of 99mTc-DTPA injected into the right caudate nucleus of normal SD rats A and C, original drawings; B and D, enlarged view of signal. P, horizontal axis; R, right sagittal; SPECT/CT, single photon emission computed tomography/computed tomography. |
2.1.2 丘脑区存在“同侧小脑优势引流”
丘脑区给药后，SPECT/CT图像显示其与尾状核区给药后的全身动态分布与消除路径相似。放射性分布从脑部开始向尾侧扩散，随着时间延长，放射性分布沿着脊柱逐渐积聚在肾和膀胱(图 3、4)。示踪剂在丘脑区注射后，首先向同侧皮层扩散，同时楔形向尾侧方向扩散，随着时间延长，沿着基底节向嗅球和小脑底部扩散，最后经脊柱进入体循环，通过肾和膀胱进行消除。但与尾状核区给药不同的是，丘脑区给药后，示踪剂从皮层逐渐扩散到小脑时，优先进入的是同侧小脑，这与尾状核区的分布特点完全相反。在左侧丘脑注入示踪剂，示踪剂随着时间不断扩散到小脑时，会优先向左侧小脑引流，然后逐步向右侧小脑扩散(图 3)；而在右侧丘脑区给药，示踪剂随着时间不断扩散到小脑时，会优先向右侧小脑引流，然后逐步向左侧小脑扩散(图 4)。
图3 正常SD大鼠左侧丘脑区注射 99mTc-DTPA的SPECT/CT图像Figure 3 SPECT/CT images of 99mTc-DTPA injected into the left thalamus of normal SD rats A and C, original drawings; B and D, enlarged view of signal. P, horizontal axis; L, left sagittal; SPECT/CT, single photon emission computed tomography/computed tomography. |
图4 正常SD大鼠右侧丘脑注射 99mTc-DTPA的SPECT/CT图像Figure 4 SPECT/CT images of 99mTc-DTPA injected into the right thalamus of normal SD rats A and C, original drawings; B and D, enlarged view of signal. P, horizontal axis; R, right sagittal; SPECT/CT, single photon emission computed tomography/computed tomography. |
2.2 99mTc-DTPA经脑ECS给药后在大鼠体内的生物分布
为定量研究核素示踪剂注入不同脑区后在全身的分布和消除情况，在 99mTc-DTPA分别注入SD大鼠的右侧尾状核区和右侧丘脑区5 h后，解剖大鼠并收集各组织器官，称重后使用全自动γ计数仪测量其放射性计数，结果显示，大脑、小脑、嗅球和尿液中的放射性摄取最高，其次是肾和血液，心、肝、脾、肺的放射性摄取最低(表 1)。
表1 正常SD大鼠分别在右侧尾状核和右侧丘脑注入99mTc-DTPA 4 h后的体内分布(n=5)Table 1 In vivo distribution of 99mTc-DTPA 4 h after injection into the right caudate nucleus and the right thalamus of normal SD rats (n=5) |
| Organs and tissues | Radioactive uptake value/(%ID/g), $\bar x \pm s$ | |
| R-Cn | R-Tha | |
| Olfactory bulb | 45.66±13.48 | 31.73±6.45 |
| Cerebellum | 26.06±16.26 | 73.70±25.17 |
| Brain-R | 159.85±85.37 | 221.93±54.04 |
| Brain-L | 28.60±13.56 | 49.73±16.64 |
| Heart | 0.44±0.30 | 1.20±0.52 |
| Liver | 0.68±0.68 | 0.87±0.39 |
| Spleen | 0.21±0.08 | 0.87±0.47 |
| Lung-R | 0.84±0.40 | 2.42±0.94 |
| Lung-L | 0.60±0.34 | 2.15±0.87 |
| Kidney-R | 2.98±1.55 | 5.30±1.50 |
| Kidney-L | 2.74±1.25 | 5.61±1.56 |
| Blood | 2.49±0.88 | 4.83±1.83 |
| Urine | 102.32±25.61 | 312.55±48.10 |
R, right; L, left; Cn, caudate nucleus; Tha, thalamus; %ID/g, percentage activity of injection dose per gram of tissue. |
不同脑区给药后各组织器官的放射性摄取也存在差异。尾状核区给药时，嗅球的放射性摄取与小脑相似(t=1.86, P=0.10)；丘脑区给药时，嗅球的放射性摄取明显低于小脑(t=3.61, P=0.01)。另外，丘脑区给药时，尿液中的放射性摄取明显高于尾状核区给药(t=10.01, P < 0.01)。经丘脑区和尾状核区给药后药物的消除路径不同，尾状核区更多的是向嗅球和小脑方向扩散，再向给药脑区对侧扩散；丘脑区更多的是向小脑方向扩散，再向嗅球和给药脑区对侧扩散，说明经不同脑区给药后的消除路径存在差异。
3 讨论
脑组织液是存在于脑间质系统的一种含有离子、气体和有机分子的水溶剂，其主要来源包括与脑脊液的交换、神经元和神经胶质细胞的代谢以及血浆内等离子体气体分子和少量疏水和脂溶性分子的被动扩散。脑组织液作为细胞间通讯和代谢废物消除的媒介，对维持脑内微环境稳态起到十分重要的作用[10-11]。Iliff等[12]将荧光示踪剂注入小鼠枕大池中，应用双光子成像技术实时监测脑内脑脊液的流动，发现蛛网膜下腔的脑脊液通过皮质动脉和穿支动脉旁的血管旁间隙进行快速流动，然后进入脑实质内与ISF进行交换，并且这种交换依靠星形胶质细胞足突末端的水通道蛋白-4(aquaporin-4，AQP4)的介导，因其发挥着类似于淋巴系统的功能，又称为“类淋巴途径”。ECS定义为脑细胞之间和脑细胞与血管之间的间隙结构，是神经细胞生存的直接微环境，其内的ISF由脑深部通过白质纤维束引流至浅表脑区，进入蛛网膜下腔后流入外周血液，也可以通过脑膜淋巴管穿过筛板到达颈深淋巴结。一些脑深部区域如尾状核、丘脑等，其内的ISF引流路径与上述不尽相同，例如通过室管膜渗透至脑室，与脑脊液交换后通过蛛网膜下腔进入外周[13-14]。因此，探究不同脑区ECS内ISF引流及消除规律至关重要。
本课题组前期应用荧光示踪和磁示踪技术发现，不同脑ECS分区内ISF的引流速度和途径各不相同[9]，且该ECS分区非常稳定，不受外界压力、水通道蛋白等因素的影响[15]。我们应用激光扫描共聚焦显微镜进一步证实了脑ECS分区的结构基础为致密有髓神经纤维束，从尾状核中追踪到的ISF沿髓鞘纤维束流向同侧皮质，而在相反的方向上，其向相邻丘脑的运动被聚集紧密的髓鞘束完全阻止，另外，在尾状核中注射荧光探针后在相邻的第三脑室中可以观察到少量荧光探针，表明通过室管膜细胞进入脑室也是组织间液从尾状核排出的途径之一。丘脑区的组织间液会通过室管膜细胞进入脑室，以及通过髓鞘纤维束流向前侧皮质进入蛛网膜下腔[13]。当肿瘤、化学毒物或者衰老导致分区结构破坏时，ECS分区内的ISF沟通出现紊乱[16]，脑细胞和神经网络的工作环境发生异常。基于上述发现，本课题组提出了脑分区稳态理论假说[7]，这一新的理论发现提示药物在经脑ECS途径给药时，在脑ECS不同分区给药后的药代动力学特征和规律可能也有所差异。因此，本研究在前期提出的“脑分区”的理论基础上，应用SPECT/CT成像研究核素示踪剂 99mTc-DTPA经脑ECS途径给药后在不同脑区的全身动态分布以及消除规律，以期为经该途径给药的临床应用和新药研发提供依据。
本研究将核素示踪剂 99mTc-DTPA经脑ECS途径给药后注入尾状核和丘脑两个不同的脑区，观察其在全身的分布规律。SPECT/CT成像结果显示，尾状核区和丘脑区给药后，放射性分布均浓聚在脑部、脊柱、肾和膀胱，但其脑内分布和消除路径存在明显差异。尾状核区给药后，其引流路径存在“对侧小脑优势引流”，而丘脑区给药的优势引流路径为“同侧小脑”。此外，SPECT/CT成像和体内分布的结果均显示，丘脑区和尾状核区给药后的全身消除途径也明显不同，尾状核区给药后更多的向头侧嗅球方向扩散，其次向尾侧小脑和给药脑区对侧扩散；而丘脑区给药后更多的是向尾侧小脑方向扩散，其次向头侧嗅球和给药脑区对侧扩散。与尾状核区给药相比，丘脑区给药后的药物消除要明显更快。本研究明确了经脑ECS途径给药后不同脑区的全身消除途径存在明显差异，进一步拓展了“脑分区”的内容与意义，同时打破了人们一直以来对药物在脑内代谢的传统认知，即药物在通过血脑屏障进入脑组织后，将整个脑组织视为一个整体来考虑药物在全脑范围内的作用分布，为今后经这一途径的药物治疗和新药研发提供了有力的支撑。
本研究选择的核素示踪剂 99mTc-DTPA为水溶性小分子物质，其相对分子质量为488.26，发射纯γ射线，对人体损伤较小，具有一定的安全性[17]，目前临床上用于肾动态显像。静脉注射 99mTc-DTPA后，经肾小球过滤迅速从血中消除，既不被肾小管排泄，也不被肾小管重吸收，24 h内注射剂量的95%排入膀胱，其中2%~6%的放射性与蛋白结合，肝胆排泄和消除可忽略，但如果血脑屏障被损伤，放射性会在脑损伤部位浓聚。99mTc-DTPA经脑ECS途径给药后，其分布和消除规律与静脉给药完全不同，放射性浓聚在脑、脊柱、肾和膀胱，且不同脑区的优势引流路径存在差异，提示我们在应用该方法治疗中枢神经系统疾病时，应充分研究药物通过脑ECS途径给药后在脑内和全身的药物分布和消除规律，也要考虑不同脑区的差异，以便为不同中枢神经系统疾病患者提供精准化的治疗。本研究选择的示踪剂在一定程度上可以代表水溶性小分子物质经脑ECS途径给药后的全身动态分布及分布规律，但大分子物质是否与小分子物质遵循同样的规律仍需进一步研究。
此外，经脑ECS途径给药的新药研发需要更有力的药代动力学模型，因此需要对不同大小的分子在不同脑区给药后的全身分布和消除规律进行全面而深入的研究，应用分析采集的成像结果提取出定量数据，结合相关的数学模型进行拟合分析，从而构建经该途径给药的药代动力学模型，这对于经脑ECS途径给药更广泛地应用于临床具有重要意义。未来随着研究的深入，期待经脑ECS途径给药可以在脑病治疗、药物研发等过程中发挥作用，为人类健康事业做出贡献。