唾液自身具有取样简便、无痛无创的独有优势，样本的采集过程不会增加患者的紧张和不适感，无需专业人员或特殊仪器设备，操作安全且支持重复取样，适用于大规模的监测与随访研究。唾液还能够较为全面地反映机体的健康状态，这主要是因为附着于牙齿及口腔软组织表面的微生物、代谢物等通过流体冲刷作用不断进入唾液，并且唾液中还包含多种宿主来源的蛋白质及生物活性分子，宿主和微生物的协同作用构成了唾液的动态功能网络，使其成为反映微生态平衡状态的重要指标，为健康监测和疾病诊断提供了科学依据[5]。
近年来，随着多种不同组学检测分析技术的出现和兴起，通过基于高精度质谱技术的蛋白质/多肽组学分析和基于高通量测序技术的微生物组学分析等技术的应用，使得唾液微生态不同组分的多维度解析与关联探索成为可能[6]。在深入挖掘生物学标志物的同时，更有助于阐明其微生态组成及功能在疾病发生和发展中的作用机制。因此，北京大学口腔医学院口腔预防医学课题组以唾液微生态作为主要研究对象，聚焦于龋病和牙周病这两种常见的口腔疾病，以及2型糖尿病、慢性肾病等全身系统性疾病，探索唾液生物学标志物在疾病早期防治中的应用价值。同时，课题组还开展了唾液不同节段及不同取样方法条件下的稳定性分析，为建立规范化的唾液取样流程，进一步实现唾液在口腔及全身疾病早期防治中的应用奠定了基础。
1 唾液微生态与龋病的早期防治
低龄儿童龋(early childhood caries，ECC)作为儿童时期的常见病、多发病，不仅对儿童的口腔健康造成直接危害，还可能影响其生长发育和全身健康状态[7]。低龄儿童龋患病率较高，且处于不断上升的态势，因此，实现低龄儿童龋综合防控措施的关口前移，已是势在必行。本课题组聚焦于低龄儿童龋的发生和发展过程，通过分析低龄儿童龋治疗前后、纵向观察过程中新发龋、治疗后再次患龋以及患龋高风险状态变化的关键节点，系统揭示了唾液蛋白质/多肽组和微生物组的特征性变化规律，并成功筛选出一系列具有潜在诊断价值的低龄儿童龋相关生物学标志物。这些发现为探索更有效的低龄儿童龋早期预防和综合防控策略奠定了重要基础。
本课题组先对重度低龄儿童龋治疗前后唾液多肽的变化情况展开研究，应用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱技术(matrix-assisted laser desorption/ ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)检测了患有重度低龄儿童龋儿童治疗前、治疗后1周和4周三个时间点唾液蛋白的差异，发现唾液中的组蛋白1(histatin-1)是区分低龄儿童龋治疗前后变化的重要生物学标志物，且在治疗后表达水平呈上升趋势[8]。课题组对于治疗后再次患龋时对应的唾液多肽改变也开展了相关研究，通过对低龄儿童龋治疗前、治疗后10天和4个月的唾液分析发现，质荷比(m/z)为3 162.0和3 290.4的两种多肽在龋病治疗后再次患龋时表达水平呈下降趋势，是龋病治疗后再次患龋的生物学标志物[9]。
与此同时，课题组通过一项为期1年的纵向研究，比较随访期间保持无龋和出现新发龋患儿唾液多肽的表达差异，发现了9种具有显著差异的多肽，其中3种特征性多肽(m/z分别为1 346.6、2 603.5和3 192.8)被用于构建患龋高风险的预测模型，展现出良好的龋病预测效能；m/z为1 346.6的多肽被鉴定为富组多肽，在龋病发生时的表达水平显著高于健康状态，提示其在预测新发龋中的重要作用[10]。
对龋病高危群体的早期识别和及时预防是控制低龄儿童龋的有效方式。本课题组构建了一个含有28名3~4岁儿童的纵向随访队列，分别在基线、基线后3个月和6个月时收集刺激性全唾液样本，根据患龋状态及观察期内的龋病进展情况将研究对象分为患龋未复发组(n=7)、患龋复发组(n=6)和健康对照组(n=15)。采用MALDI-TOF MS技术检测各组样本唾液蛋白的表达情况，筛选出的颌下腺雄激素调节蛋白3B(submandibular gland androgen regulatory protein 3B，SMR-3B)和黏蛋白7(mucin-7)可作为动态监测早期低龄儿童龋高风险状态变化的潜在生物学标志物。基于这两种蛋白质构建筛选患龋高风险状态个体的决策树模型，对龋病高风险状态变化的判别灵敏度可达84.6%，适用于儿童患龋高风险状态的动态监测与早期预警[11]。
在龋病发生和发展过程中，唾液菌群的组成、结构及功能均发生了改变，多种特征性表达的微生物在龋病及健康人群间的分布都具有显著差异。课题组在唾液微生物组与龋病关联的研究方向也取得了一定的成果。通过人类口腔微生物芯片(humanoral microbe identification microarray，HOMIM)对患有及不患有严重低龄儿童龋的3~4岁儿童开展比较分析，结果表明变异链球菌(Streptococcus mutans)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas)及放线菌属(Actinomyces)与重度低龄儿童龋有极强的相关性[12]。值得注意的是，唾液微生物的特征性变化不仅能有效区分健康无龋与患龋状态，还具有预测龋病治疗后转归的潜力，可以作为预测治疗后再次患龋风险的生物学标志物。本课题组的另一项研究通过对无龋及患龋的3~5岁儿童分别开展为期12个月的纵向观察研究，对是否出现治疗后再次患龋的情况进行检查和记录，最终发现联合梭杆菌属(Fusobacterium)、普雷沃菌属(Prevotella)、纤毛菌属(Leptotrichia)和二氧化碳噬纤维菌属(Capnocytophaga)四种微生物的特征性表达趋势组合，可建立效能优异的治疗后再次患龋预测模型[受试者工作特征曲线下面积(area under the curve，AUC)可达0.952][13]。这些唾液微生物组生物学标志物在对高风险群体开展早期判别和疗效预测等多个方面具有重要的应用前景。
2 唾液微生态与牙周病的早期防治
牙周病是指发生在牙周支持组织的各种疾病，其中以牙龈炎和牙周炎最常见。根据全国口腔健康流行病学调查结果，我国中老年人牙周健康状况处于较差状态，且近年来牙周疾病的严重程度不断加重，牙周炎已经成为中老年人牙齿缺失的主要原因，大大加重了口腔疾病负担。牙周病是一个复杂的病理过程，本课题组在开展研究的过程中，聚焦于唾液中蛋白质/多肽组及微生物组的动态变化，系统探索其在牙周病早期防治中的应用价值。
微生物是牙周疾病发生和发展的始动因子，唾液微生物组的变化与疾病状态的关系还需进一步研究。通过高通量全长测序技术，课题组构建了牙周健康、牙龈炎和牙周炎个体的唾液游离菌群图谱[17]。结果显示，随着牙周炎症程度的进展，唾液中健康相关菌[如链球菌属(Streptococcus)、嗜血杆菌属(Haemophilus)等]逐渐减少，而牙周病致病菌[如卟啉单胞菌属、密螺旋体属(Treponema)]呈现出显著的富集趋势。唾液微生物组的这种特征可以为牙周病的早期筛查与亚型判别提供进一步的依据，也是在牙周病早期防治中开展筛查与监测的重要切入点。
3 唾液微生态与全身疾病的早期防治
3.1 唾液微生态与2型糖尿病的早期防治
本课题组的一项研究基于59例中老年T2DM患者，通过Label-free定量蛋白质组学技术对血糖控制良好与控制不良人群的唾液样本进行比较，共鉴定出402种差异表达蛋白，涉及免疫调节、氧化应激和糖代谢等关键功能通路[21]。该研究发现，炎症相关蛋白，如乳铁转运蛋白(lactotransferrin)和补体C3在血糖控制不良组显著上调，而与抗氧化功能相关的蛋白则呈下调趋势，提示唾液蛋白质组可作为糖尿病控制状况的重要指标。
另一项纳入50例T2DM合并牙周炎患者的纵向研究[22]，通过对不同治疗方案(基础治疗与强化治疗)前后(基线、1个月和3个月)的唾液蛋白质组进行动态分析，发现包括乳铁转运蛋白、α-淀粉酶和补体C3等在内的多种蛋白表达水平均随治疗发生显著变化，且与牙周临床指标(如牙周探诊深度、附着丧失水平等)改善趋势一致，表明唾液蛋白质组可用于疗效监测和辅助个体化治疗。
此外，本课题组还通过微生物组和代谢组联合分析，比较了血糖控制状态不同的T2DM合并牙周炎患者(n=42)的唾液和龈沟液特征。结果显示，高血糖状态下，唾液菌群结构显著改变，非典型韦荣菌(Veillonella atypica)等致病菌富集，并与促炎性代谢物(如乳酸、腐胺等)呈正相关。本研究共鉴定出235种代谢物，其中19种与血糖控制状态显著相关，且在预测血糖控制水平方面具有较高诊断效能(AUC值为0.927)。研究进一步提示，相比龈沟液，唾液在反映口腔微生态紊乱和系统代谢状态方面更具敏感性，具备作为T2DM口腔并发症的无创生物学标志物的临床应用条件。
3.2 唾液微生态与慢性肾病的早期防治
本课题组还关注唾液生物学标志物在慢性肾病中的应用潜力。一项针对慢性肾病(chronic kidney disease，CKD)血液透析患者的研究[23]，采用MALDI-TOF MS结合弱阳离子交换磁珠(weak cation exchange magnetic beads，WCX-MB)技术对30例血液透析患者与35例健康人群的唾液多肽谱进行对比，结合超高效液相色谱-串联质谱联用技术(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)鉴定出8种显著差异表达多肽，包括组蛋白1、黏蛋白7和酸性唾液脯氨酸富集蛋白1/2(acidic proline-rich proteins 1/2，aPRP 1/2)等。通过3个关键多肽(m/z分别为2 474.9、2 113.5和1 226.7)构建的K近邻算法(K-nearest neighbors algorithm，KNN)模型在区分CKD患者中显示出良好性能(敏感性83.33%，特异性82.86%，AUC为0.855)。此外，血液透析组唾液pH显著升高，且m/z为2 113.5的多肽与血清肌酐和尿素浓度正相关，提示该多肽与肾功能损伤有关。研究表明，唾液中多肽异常表达不仅可反映CKD相关全身性病理过程，还具有作为非侵入性筛查工具的潜力，进一步拓展了唾液标志物在系统性疾病诊断、筛查与疗效判断中的应用场景。
4 唾液微生态应用于疾病早期防治的稳定性分析
唾液作为反映机体健康与疾病状态的重要生物信息库，其成分变化与多种病理生理过程密切相关。在口腔微生态的研究中，唾液样本的质量控制始于规范化的样本采集环节，并直接影响唾液分析的准确性和可靠性。研究表明，唾液成分易受环境因素、个体健康状态及样本收集方式(包括取样节段和刺激方法等)等多种因素影响。基于近年来唾液组学在口腔及全身疾病生物学标志物领域的重要进展，本课题组开展了唾液取样的方法学研究，旨在阐明不同的样本收集方法和时序动态检测对唾液不同组分的影响，为筛选具有环境适应稳定性的唾液生物学标志物奠定了基础，有助于优化唾液样本的规范化采集流程，为唾液组学在疾病诊断和健康监测中的应用提供了重要依据。
课题组还对不同的取样状态及节段效应对唾液不同组分的影响开展了系列研究。在严格控制大部分混杂因素(饮食、口腔卫生习惯等)的前提下，对全身及口腔健康的唾液捐献者开展短期纵向研究，运用交叉设计连续3天收集不同取样方法和节段的唾液样本(即非刺激性唾液前段和中段、机械刺激性唾液前段和中段)，结果表明在相同取样方法条件下，前段和中段唾液的微生物组构成高度相似，采用多时间点重复取样策略可以尽可能规避其动态变化对微生物组所带来的明显干扰[26]。不同取样方法对蛋白质/多肽组影响的对比结果表明，非刺激性和刺激性唾液之间具有显著差异，刺激性唾液所含组分种类更为丰富，且唾液蛋白质/多肽组存在前/中段效应[27]。此外，课题组也在不同的取样刺激方法对唾液组分的影响方面开展了系统研究[28]，发现嗅觉刺激、味觉刺激和咀嚼刺激均可以增加唾液流速，但这三种刺激方式对唾液多肽组和菌群组成结构的影响存在差异，嗅觉刺激对唾液多肽组和菌群组成结构的影响较小，而味觉刺激和咀嚼刺激可导致多肽组和菌群组成结构发生显著改变。
此外，课题组进一步分析了基于不同取样刺激条件唾液激素水平的变化情况，发现机械刺激会对激素水平造成较为显著的影响，激素分泌率变化和唾液流率之间的异步性是导致这一现象的最主要原因[29]。综合上述研究结果，课题组提出，在开展唾液相关研究取样时应选定同一种取样方法，并在取样全程保持一致，以避免不同节段和取样方法对唾液组分的影响，同时课题组还阐述了多时间点重复取样策略的意义；这些成果都为取样方案的标准化制定提供了重要的科学依据，并为唾液样本应用于口腔及全身疾病的早期防治奠定了基础。
5 结论与展望
综上所述，本课题组基于唾液的稳定性及取样过程中的优势，利用高精度质谱的口腔蛋白质/多肽组学技术和高通量测序的口腔微生物组学等多种组学技术，系统挖掘了唾液微生态中与口腔和全身系统性疾病相关的多组学生物学标志物，为疾病的动态监测和早期防治奠定了坚实基础。当前，唾液微生态多组学生物学标志物在疾病诊断领域的研究正处于快速发展阶段，未来课题组将基于更为深入的研究，融合纳米医学领域的各项新技术和新方法，进一步探寻具有更高灵敏度、特异度与判别能力的多组学生物学标志物组合并开展验证工作，优化基于唾液微生态生物学标志物的疾病防控策略，探索基于唾液微生态及与其相关联的全身其他系统微生态的靶向调控技术，为建立疾病早期预警系统及口腔-全身系统疾病的协同调控乃至实现家庭自我健康管理，提供更为强劲的技术支撑。