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Journal of Peking University(Health Sciences) >

2025 , Vol. 57 >Issue 6: 1113 - 1123

DOI: https://doi.org/10.19723/j.issn.1671-167X.2025.06.015

Effect of dephosphorylation of tumor metastasis suppressor gene LASS2 on vacuolar ATPase activity and invasiveness of prostate cancer

  • Yanhua LIU 1 ,
  • Min LU 1 ,
  • Xuyang ZHAO 2 ,
  • Kuan'gen ZHANG 1 ,
  • Rui WU 1 ,
  • Fang MEI 1 ,
  • Zhihao DAI 1 ,
  • Jiangfeng YOU 1 ,
  • Fei PEI , 1, *
Expand
  • 1. Department of Pathology, School of Basic Medical Sciences Peking University / Peking University Third Hospital, Beijing 100191, China
  • 2. Peking University Institute of Systems Biomedicine, Beijing 100191, China
PEI Fei, e-mail,

Received date: 2023-05-22

  Online published: 2025-03-17

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the National Natural Science Foundation of China(81572533)

Beijing Natural Sciences Foundation(7182078)

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Abstract

Objective: To explore the effects and the molecular mechanisms of homo sapiens longevity assurance homolog 2 of yeast LAG1(LASS2) dephosphorylation on the biological functions of prostate cancer cells. Methods: Firstly, we examined the expression profiles of LASS2 by immunohistochemical staining using microarray sections from 90 human patients with prostate cancer; then FLAG-tagged LASS2 plasmid was transferred into HEK 293T cells and phosphorylation sites was detected by mass spectrometry. Furthermore, we constructed five phosphorylation-deficient mutants of LASS2 and stably transfected the variants to human prostate cancer cell line PC-3M-1E8 cell with high metastatic potential. The cell biology functions of LASS2 and its five mutants were studied using growth curve, MTT assay, plate colony formation assay, wound migration assay, matrigel invasion study and flow cytometry; and the effect of LASS2 and its phosphorylation-deficient mutants on the physical interaction between LASS2 and ATP6V0C (C subunit of V0 domain of the vacuolar ATPase), ATP6V0C expression, vacuolar ATPase (V-ATPase) activity, extracellular hydrogen ion concentration and secretion of active matrix metalloproteinase 2(MMP-2) was detected. Finally, we examined the effect of protein phosphatase inhibitor calyculin A on growth, migration and invasion of aggressive prostate cancer cells. Results: LASS2 levels decreased with increasing Gleason scores of prostate cancer tissues by immunohistochemical staining; moreover, proteome analysis by mass spectrometry had identified that three residues in the C-terminal region of LASS2(Ser-341, Ser-348, and Ser-349) were phosphorylated. Dephosphorylation of LASS2 at serine residue 348 significantly enhanced growth, migration (from 49.11%±5.62% to 74.28%±8.77%, P < 0.001) and invasion (from 129.67±13.65 to 206.67±13.50, P < 0.001) of prostate cancer cells, decreased S phase arrest (from 44.17% to 37.90%, P < 0.05) and inhibited cell apoptosis (from 48.540%±0.269% to 29.700%±0.778%, P < 0.05) in vivo through increasing V-ATPase activity, extracellular hydrogen ion concentration and secretion of active MMP-2. Calyculin A significantly reduced growth and invasion of metastatic human prostate cancer cells. Conclusion: Phosphorylation of LASS2 is essential for regulation of V-ATPase activity, and serine residue 348 of LASS2 is illustrated to be a key phosphorylation site. Phosphorylated LASS2 inhibits prostate cancer cell invasion via negative regulation of V-ATPase activity and protein phosphatase inhibitors are potential therapeutic strategy in aggressive prostate cancer.

Key words： Prostatic neoplasms; Neoplasm invasiveness; Gene expression regulation, neoplastic; Vacuolar proton-translocating ATPases; LASS2 gene

Cite this article

Yanhua LIU , Min LU , Xuyang ZHAO , Kuan'gen ZHANG , Rui WU , Fang MEI , Zhihao DAI , Jiangfeng YOU , Fei PEI . Effect of dephosphorylation of tumor metastasis suppressor gene LASS2 on vacuolar ATPase activity and invasiveness of prostate cancer[J]. Journal of Peking University(Health Sciences), 2025 , 57(6) : 1113 -1123 . DOI: 10.19723/j.issn.1671-167X.2025.06.015

前列腺癌是全世界男性最常见的恶性肿瘤之一[1]，随着生活水平的不断提高，中国前列腺癌的发病率也在逐年增加[2]。但前列腺癌的预后在临床上却表现出明显的差异，非转移性前列腺癌患者的五年生存期可高达99%，而一旦进展为转移性前列腺癌，患者的五年生存期迅速降为30%[1]。因此，寻找与前列腺癌转移相关的基因，对其转移机制进行系统研究，并以此来设计药物靶点，或许可以更好地改善转移性前列腺癌患者的预后。
人源酵母LAG1长寿同源物2(homo sapiens longevity assurance homolog 2 of yeast LAG1，LASS2)基因也称为肿瘤转移抑制基因1(tumor metastasis suppressor gene 1，TMSG1)，是北京大学基础医学院病理学系于1999年从人前列腺癌细胞系PC-3M中鉴定出的一种肿瘤转移抑制基因[3-4]，因其具有催化鞘氨醇和脂肪酰辅酶A(coenzyme A，CoA)合成超长酰基链(C22~C24)神经酰胺的功能，故又称为神经酰胺合成酶2(ceramide synthase 2，CERS2)[5-6]。LASS2蛋白由一个保守的homeobox结构域和一个Tram-Lag1-CLN8(TLC)结构域组成，存在7个潜在的蛋白激酶磷酸化位点，散在分布于LASS2的两个结构域和羧基末端[7-8]。TLC结构域被认为是神经酰胺合成所必需的，尤其是Lag1p这一由52个氨基酸组成的保守片段(氨基酸203~254)[9-10]。但缺乏homeobox结构域的LASS2则不能发挥其催化功能[9]，并且LASS2蛋白羧基末端的磷酸化也参与了其神经酰胺酶活性的调节[8]，因此，对LASS2生物学活性的分子调节机制仍需进一步探索。
液泡型ATP酶(vacuolar ATPase，V-ATPase)是一种依赖于ATP供能的以逆浓度梯度转运H+的质子泵[11]，由V0和V1两个多聚复合体组成，其中V1复合体位于细胞质内，具有水解ATP的功能，而V0复合体嵌合在细胞膜或细胞器膜上，介导H+的跨膜转运[12]。V0复合体中的c亚基又被称为ATP6V0C，在前列腺癌、结直肠癌和乳腺癌等多种肿瘤中表达升高，并且与肿瘤的侵袭、转移以及预后差正相关[13-17]。
LASS2通过与ATP6V0C相互作用抑制V-ATPase活性，进而降低细胞外H+浓度和抑制金属基质蛋白酶活性，并最终抑制前列腺癌细胞的增殖、侵袭和转移[14-15, 18]。然而，LASS2与ATP6V0C相互作用的分子机制和调节V-ATPase活性的关键位点尚不清楚。因此，本研究旨在通过质谱分析、免疫共沉淀等实验发现LASS2磷酸化位点，探索这些磷酸化位点对LASS2与ATP6V0C相互作用的影响，以进一步研究LASS2抑制前列腺癌迁移和侵袭能力的机制，寻找潜在的前列腺癌干预策略。

1 资料与方法

1.1 病例选择和标本

顺序选择2018年7月至2020年7月于北京大学第三医院手术的90例前列腺癌患者的癌组织和邻近的非肿瘤组织。患者年龄55~89岁(平均69岁), 其中29例(32.2%)Gleason评分为6分，34例(37.8%)为7分，13例(14.4%)为8分，14例(15.6%)为9分。本研究获得北京大学生物医学伦理委员会的审批(审批号：PUIRB-YS2023091)，所有参与者均知情同意，所有实验均按照相关指南和规定进行。

1.2 组织芯片制备和免疫组织化学染色

包含90例前列腺癌患者癌组织及邻近非肿瘤组织的组织芯片由上海芯超生物科技有限公司(中国)制备。采用免疫组织化学染色法检测LASS2蛋白表达，一抗为抗LASS2抗体(Santa Cruz公司，1 ∶ 500稀释)。LASS2染色评分标准如下：染色强度分为0分(阴性)、1分(弱阳性)、2分(中等阳性)和3分(强阳性)，阳性细胞染色比例分为0分(＜5%阳性)、1分(5%~25%)、2分(26%~50%)、3分(51%~75%)和4分(＞75%)；最终得分为染色强度和染色比例分数的乘积，得分范围为0~12分。

1.3 构建LASS2全长或突变质粒

采用逆转录聚合酶链反应从人前列腺癌细胞系PC-3M-2B4 cDNA文库(来自人前列腺癌细胞PC-3M的非转移亚系)中克隆LASS2的全长cDNA(GenBank登录号：NM_181746)，并连接到含有FLAG标签(DYKDDDDK)的pcDNA3.1载体(Invitrogen)的XbaⅠ/EcoRⅠ位点。然后以LASS2全长质粒为模板，采用不同引物进行PCR扩增以获得LASS2不同位点的去磷酸化突变体质粒，引物序列见表 1。
表1 构建质粒所用引物序列

Table 1 Nucleotide sequences of primers used in plasmid construct

Gene Primer
LASS2 Forward: 5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAATGCTCCAGACCTTGTATGATTA-3′
Reverse: 5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTAGTCATTCTTACGATGGTTGT-3′
LASS2-T332A Forward: 5′-TACCAGCTTTCCAGCTATGAACTTGTGGGCCATG-3′
Reverse: 5′-CATGGCCCACAAGTTCATAGCTGGAAAGCTGGTA-3′
LASS2-S341A Forward: 5′-TCTGTTTCTTCCCGGTCAGCGCGTTCATCTTCTACCAG-3′
Reverse: 5′-CTGGTAGAAGATGAACGCGCTGACCGGGAAGAAACAGA-3′
LASS2-T346A Forward: 5′-CTCTGAGCTCTCTGCTTCTTCCCGGTCACTGC-3′
Reverse: 5′-GCAGTGACCGGGAAGAAGCAGAGAGCTCAGAG-3′
LASS2-S348A Forward: 5′-TCCTCCCCCTCTGAGGCCTCTGTTTCTTCCCG-3′
Reverse: 5′-CGGGAAGAAACAGAGGCCTCAGAGGGGGAGGA-3′
LASS2-S349A Forward: 5′-CCTCCTCCCCCTCTGCGCTCTCTGTTTCTTC-3′
Reverse: 5′-GAAGAAACAGAGAGCGCAGAGGGGGAGGAGG-3′

LASS2, homo sapiens longevity assurance homolog 2 of yeast LAG1.

1.4 质谱法分析LASS2蛋白的磷酸化位点

在磷酸酶抑制剂存在的条件下，将过表达FLAG-LASS2质粒的HEK 293T细胞裂解后，使用抗FLAG琼脂糖珠进行免疫共沉淀，然后采用FLAG肽与琼脂糖珠一起孵育以洗脱FLAG蛋白及其结合蛋白。收集洗脱液行SDS-PAGE凝胶电泳，采用银染法进行显色，胶回收后通过液相色谱-串联质谱法(安捷伦6340)检测磷酸肽。

1.5 细胞培养和转染

人前列腺癌细胞系PC-3M[研究资源识别码(research resource identifiers，RRID)：CVCL_9555]和HEK 293T细胞(RRID：CVCL_KS65)购自美国生物标准品资源中心(American Type Culture Collection，ATCC)，人前列腺癌细胞系PC-3M高转移潜能亚系PC-3M-1E8细胞(RRID：CVCL_G257)由北京大学基础医学院病理学系建立[3]。因为与低转移潜能的前列腺癌细胞系(PC-3M-2B4、PC-3和LNCap细胞)相比，高转移潜能的前列腺癌细胞系(PC-3M-1E8和PC-3M细胞)中LASS2的表达量较低，而ATP6V0C的表达量较高[18]，所以选择PC-3M-1E8细胞作为本研究的主要实验细胞。本研究使用的细胞系均送至上海翼和应用生物技术有限公司进行短串联重复序列(short tandem repeat，STR)图谱鉴定，并被证实与ATCC报告的图谱相同。HEK 293T细胞采用MEM培养基(Gibco，美国)培养，PC-3M-1E8细胞采用RPMI-1640培养基(Gibco，美国)培养。所有细胞培养基在使用时均添加10%(体积分数)胎牛血清(HyClone，美国)和1%(体积分数)青霉素-链霉素混合液(普利莱，中国)，并于37 ℃、5%(体积分数)CO2培养箱中培养。行药物研究时，分别向培养基中加入0.75 nmol/L的蛋白磷酸酶抑制剂calyculin A(MedChem Express，美国)或2 nmol/L的紫杉醇(Macklin，中国)。所有细胞均采用Lipofectamine 2000试剂盒(Invitrogen，美国)进行质粒转染。

1.6 细胞生长曲线

取对数生长期的稳定转染不同质粒的PC-3M-1E8细胞，以每孔1×104个细胞的密度接种于24孔板，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。自次日起每天每组细胞取3孔细胞进行活细胞计数，取其平均值，连续6 d，并绘制生长曲线。

1.7 MTT掺入实验

取对数生长期的稳定转染不同质粒的PC-3M-1E8细胞，以每孔2×103个细胞的密度接种于96孔板，每组设置6个复孔，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。自次日起每天于测定前4 h每孔加入20 μL MTT溶液(5 g/L)，于37 ℃、5%CO2培养箱中继续培养4 h后每孔加入150 μL二甲基亚砜(dime-thyl sulfoxide，DMSO)溶解结晶，30 min内在酶标仪上测定595 nm处的光密度值。

1.8 平板克隆形成实验

将稳定表达FLAG标记的LASS2 野生型(wild type LASS2, LASS2-WT)或LASS2突变体的PC-3M-1E8细胞以100个细胞/孔的密度接种在6孔板中，并在含有终浓度为1.2 g/L G418的完全生长培养基中孵育2周。细胞集落用4%(体积分数)多聚甲醛固定，用0.5%(体积分数)结晶紫染色，拍照后用ImageJ进行统计分析。

1.9 细胞划痕修复试验

细胞转染48 h后，每组细胞均用移液器划出划痕，用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)轻洗细胞3次，重新加入含5%胎牛血清的RPMI-1640培养基，并于倒置显微镜下观察拍照，以记录0 h划痕宽度。将细胞置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中继续培养24 h，取出细胞于倒置显微镜下观察照相，以记录24 h划痕宽度，并计算其划痕修复率。实验重复3次。

1.10 Transwell细胞侵袭实验

基底胶用无血清DMEM稀释为终浓度1 g/L，Transwell上室均匀铺50 μL稀释好的基底胶(Corning，BD Biocoat)，并将小室置于37 ℃温箱中孵育30 min。Transwell下室加入NIH 3T3细胞的培养上清作为趋化因子。每个Transwell上室加入200 μL细胞悬液(1×108个细胞/L)，于37 ℃、5%CO2孵育箱中继续培养16 h。湿棉签擦去膜表面未侵袭的细胞，PBS漂洗2遍后用4% 多聚甲醛固定30 min，然后用5 g/L(0.5%)结晶紫染色20 min。于倒置显微镜下200倍拍照并统计视野下的穿膜细胞数。

1.11 细胞周期检测

将1×106个细胞接种于6孔板中，给予相应的处理。胰酶消化细胞后用冰PBS洗涤细胞2次，75%(体积分数)乙醇固定细胞，4 ℃冰箱过夜。PBS洗涤细胞后采用300目尼龙网过滤得到单细胞悬浮液。加入10 μL RNase(翌圣公司，中国)，37 ℃水浴锅孵育30 min，上机检测前用50 mg/L碘化丙锭(翌圣公司，中国)染色，使用流式细胞仪(FACS，Becton Dickinson，美国)进行分析。

1.12 细胞凋亡检测

将1×106个细胞接种于6孔板中，给予相应的处理。胰酶消化细胞后用PBS洗涤细胞，用0.5 mL PBS重悬细胞，300目尼龙网过滤细胞。离心后加入0.5 mL结合缓冲液重悬细胞，加入10 μL Annexin- V-FITC和5 μL碘化丙锭，然后采用流式细胞仪进行分析。

1.13 Western blot实验

细胞裂解后提取细胞总蛋白并进行10% SDS-PAGE凝胶电泳，转膜和封闭后分别使用FLAG抗体(Sigma，1 ∶ 2 000)、ATP6V0C抗体(ABclonal，1 ∶ 500)、Myc标签抗体(Abcam，1 ∶ 1 000)和β-actin(中杉金桥，1 ∶ 1 000)进行免疫杂交。

1.14 免疫共沉淀实验

细胞裂解后提取细胞总蛋白加入FLAG抗体或IgG抗体过夜孵育，第2天加入重组蛋白A/G磁珠(Bimake，美国)进行免疫吸附，用洗涤液洗磁珠3遍后，加入上样缓冲液，于95 ℃煮样10 min，然后进行Western blot检测。

1.15 谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白沉降技术(GST pull-down)

将表达谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase，GST)质粒或GST-ATP6V0C质粒的菌种加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG，终浓度为0.1 mmol/L)诱导后继续培养16 h，将其裂解产物与GST融合蛋白纯化磁珠共孵育2 h。将体外翻译的FLAG-LASS2与上述磁珠共孵育2 h，用洗涤液洗磁珠3次后，加入上样缓冲液，于95 ℃煮样10 min，然后进行Western blot检测。

1.16 V-ATPase活性的检测

FLAG- LASS2 WT或LASS2突变体转染PC-3M-1E8细胞48 h后，使用V-ATPase活性比色定量检测试剂盒(Genmed Scientifics，美国)检测细胞的V-ATPase活性，即采用比色法使用紫外分光光度仪测定其氧化后峰值(NADH浓度)的变化，以此测算单位酶活性。

1.17 细胞外H+浓度测定

FLAG- LASS2 WT或LASS2突变体转染PC-3M-1E8细胞48 h，用无血清RPMI-1640培养基[1 mmol/L NaHCO3(pH 7.0)]继续培养细胞24 h，然后采用pH敏感染料BCECF/AM(Sigma，美国)测量细胞外H+浓度(pH)[14]。

1.18 明胶酶谱实验

FLAG- LASS2 WT或LASS2突变体转染PC-3M-1E8细胞48 h后，用无血清RPMI-1640培养基继续培养细胞24 h，采用基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)明胶酶谱试剂盒(Qiagen)检测细胞培养上清液中MMP-2和MMP-9的活性。

1.19 统计学分析方法

采用SPSS 24.0软件完成统计分析，数据用均值±标准差表示。基因表达量、细胞功能实验结果两组间比较采用t检验；3组及以上多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两组间比较采用LSD法。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LASS2是前列腺癌的潜在预后标记物

免疫组织化学染色结果表明，LASS2在前列腺组织细胞质和/或细胞膜阳性表达(图 1A)，与邻近正常前列腺组织相比，前列腺癌组织中LASS2水平显著下调(P < 0.01, 图 1B)，且LASS2蛋白表达水平随前列腺癌组织Gleason评分的增加而降低(P < 0.01，图 1C)，表明LASS2蛋白表达与前列腺癌的侵袭性之间存在明显的负相关，提示LASS2可能是前列腺癌潜在的预后标志物。
图1 LASS2在前列腺癌及癌旁组织中的表达

Figure 1 Expression level of LASS2 in prostate cancer and adjacent tissue

A, immunohistochemical staining of LASS2 in 90 prostate carcinoma samples with paired adjacent normal tissues. Representative sections from prostate cancer (Gleason score 6, 7, 8, 9) or adjacent normal tissue stained with HE and LASS2 antibody are presented (×200). B, LASS2 levels was significantly downregulated in prostate cancer tissues compared with paired adjacent normal tissues (P < 0.01); C, LASS2 levels decreased with increasing Gleason scores of prostate cancer tissues (P < 0.01). HE, hematoxylin-eosin; LASS2, homo sapiens longevity assurance homolog 2 of yeast LAG1.

2.2 LASS2的C末端存在3个丝氨酸磷酸化位点

采用PROSITE软件(http://prosite.expasy.org/) 进行蛋白质分析, 预测出LASS2包含7个丝氨酸磷酸化位点(Ser-91、Ser-110、Ser-137、Ser-248、Ser-341、Ser-348和Ser-349)，并且这些磷酸化位点在人类、小鼠和大鼠中高度保守(图 2A)。为了探索LASS2磷酸化的精确位点，在磷酸酶抑制剂存在的条件下，对转染FLAG-LASS2的HEK 293T细胞进行了免疫共沉淀串联质谱分析，最后在LASS2的C末端鉴定出3个丝氨酸磷酸化位点(Ser-341、Ser-348和Ser-349，图 2B)。
图2 LASS2的C末端丝氨酸磷酸化位点

Figure 2 Serine phosphorylation site at the C-terminus of LASS2

A, protein analysis using PROSITE (http://prosite.expasy.org/) predicted that LASS2 contained seven protein serine phosphorylation sites, and these phosphorylation sites are highly conserved among human, mouse and rat; B, FLAG-LASS2 was purified from transfected HEK 293T cells in the presence of phosphatase inhibitor and subjected to mass spectrometric analysis. Phosphoproteomic study has identified three serine phosphorylation sites in the C-terminal of LASS2. LASS2, homo sapiens longevity assurance homolog 2 of yeast LAG1.

2.3 LASS2-S348A去磷酸化突变体促进PC-3M-1E8细胞的生长、迁移和侵袭

为研究LASS2磷酸化对PC-3M-1E8细胞的生物学作用，本研究观察了LASS2及其突变体对PC-3M-1-E8细胞生长、迁移和侵袭的影响。细胞生长曲线和MTT实验显示，与LASS2-WT相比，LASS2-S348A和Vector转染的PC-3M-1E8细胞从第6天开始出现明显的生长加速(图 3A)。细胞集落形成实验显示，稳定转染Vector、LASS2-WT、LASS2-T332A、LASS2-S341A、LASS2-T346A、LASS2-S348A和LASS2-S349A的PC-3M-1E8细胞在2周内形成的细胞集落数分别为46.0±1.0、23.7±3.8、30.0± 6.6、27.3±3.2、26.7±2.1；40.7±2.1和43.3±2.1，与LASS2-WT相比，转染LASS2-S348A、LASS2-S349A或Vector的PC-3M-1E8细胞在2周内形成的细胞集落显著增加(图 3B)。
图3 LASS2-WT及其突变体对前列腺癌细胞系PC-3M-1E8生长、迁移和侵袭能力的影响

Figure 3 Effects of LASS2-WT and its mutants on the growth, migration, and invasion ability of prostate cancer cell line PC-3M-1E8

A, growth curve assay and MTT test (n=3); B, cell cloning experiment (n=3); C, cell migration experiment (n=4); D, cell invasion experiment (n=3); E, cell cycle experiment; F, cell apoptosis experiment (n=3). These figures showed dephosphorylation of LASS2 at serine residue 348 promote growth, migration and invasion of PC-3M-1E8 cells. LASS2, homo sapiens longevity assurance homolog 2 of yeast LAG1; *P < 0.05, * *P < 0.01, * * *P < 0.001 vs. LASS2-WT.

细胞划痕实验显示，转染Vector、LASS2-WT、LASS2-T332A、LASS2-S341A、LASS2-T346A、LASS2-S348A和LASS2-S349A质粒的PC-3M-1E8细胞在24 h的迁移率分别为73.25%±12.38%、49.11%± 5.62%、60.06%±3.77%、51.95%±5.77%、50.60%±4.52%、74.28%±8.77%和73.15%±15.28%；与LASS2-WT相比，转染LASS2-S348A、LASS2-S349A或Vector质粒的PC-3M-1E8细胞的迁移率显著升高(图 3C)。此外，Transwell侵袭实验显示，转染Vector、LASS2-WT、LASS2-T332A、LASS2-S341A、LASS2-T346A、LASS2-S348A和LASS2-S349A质粒的PC-3M-1E8细胞在16 h内穿过基底胶的数目分别为317.33±10.21、129.67±13.65、278.67±5.51、155.50±8.89、146.00±3.61、206.67± 13.50和280.00±19.49；与LASS2-WT相比，转染LASS2-S348A、LASS2-S349A、LASS2-T332A或Vector的PC-3M-1E8细胞的侵袭能力显著增强(图 3D)。
鉴于LASS2磷酸化在PC-3M-1E8细胞生物学行为中的重要作用，本研究采用流式细胞术检测了LASS2磷酸化对前列腺癌细胞周期和凋亡的影响。结果显示，转染Vector、LASS2-WT、LASS2-T332A、LASS2-S341A、LASS2-T346A、LASS2-S348A和LASS2-S349A质粒的PC-3M-1E8细胞的S期分别为33.68%、44.17%、45.09%、40.87%、52.51%、37.90% 和48.07%；与LASS2-WT或LASS2的其他4个突变体相比，转染LASS2-S348A和Vector质粒的PC-3M-1E8细胞的S期显著降低(图 3E)。此外，转染Vector、LASS2-WT、LASS2-T332A、LASS2-S341A、LASS2-T346A、LASS2-S348A和LASS2-S349A质粒的PC-3M-1E8细胞的凋亡率分别为33.825%±6.710%、48.540%±0.269%、42.560%± 1.683%、43.230%±0.255%、49.320%±0.382%、29.700%±0.778% 和43.230%±8.259%；与LASS2-WT相比，转染LASS2-S348A或Vector的PC-3M-1E8细胞的凋亡率显著降低(图 3F)。

2.4 LASS2 S348A去磷酸化突变体增强V-ATPase活性和细胞外H+浓度

为探索磷酸化修饰对LASS2和ATP6V0C相互作用的意义，本研究首先构建了5个LASS2去磷酸化突变体，其中T332、S341、T346、S348和S349残基被Ala残基取代(分别命名为LASS2-T332A、LASS2- S341A、LASS2-T346A、LASS2-S348A和LASS2-S349A)。蛋白质免疫印迹分析显示，LASS2蛋白的去磷酸化突变体对ATP6V0C蛋白的表达没有影响(图 4A)，提示LASS2 C末端的磷酸化不影响ATP6V0C蛋白的表达。将Myc- ATP6V0C分别与FLAG标记的LASS2去磷酸化突变体瞬时共转染HEK 293T细胞进行免疫共沉淀，发现LASS2-S348A和LASS2-S349A去磷酸化突变体与ATP6V0C蛋白之间的结合能力减弱(图 4B)。GST pull-down实验结果表明，体外转录翻译的LASS2-S348A和LASS2-S349A突变体与ATP6V0C结合能力明显减弱(图 4C)，尤其是LASS2-S348A。上述结果表明, LASS2-S348磷酸化会影响LASS2和ATP6V0C之间的结合。
图4 LASS2-WT及其突变体对前列腺癌细胞系PC-3M-1E8 V-ATPase活性和细胞外H+浓度的影响

Figure 4 Effects of LASS2-WT and its mutants on V-ATPase activity and extracellular H+ concentration in prostate cancer cell line PC-3M-1E8

A, Western blotting; B, co-immunoprecipitation; C, GST pull-down; D, V-ATPase activity detection experiment (n=3); E, extracellular H+ detection experiment (n=6); F, gelatin enzyme spectrum experiment. These figures showed that LASS2-S348A dephosphorylation mutant enhances V-ATPase activity and extracellular H+ concentration. LASS2, homo sapiens longevity assurance homolog 2 of yeast LAG1; WT, wild type; V-ATPase, vacuolar ATPase; ATP6V0C, C subunit of V0 domain of the V-ATPase; GST, glutathione-S-transferase; MMP, matrix metalloproteinase. *P < 0.05, * *P < 0.01, * * *P < 0.001.

ATP6V0C作为V-ATPase V0结构域的重要组成亚基，对于其发挥质子泵的生物学功能非常关键[15]。为进一步探索LASS2磷酸化对V-ATPase功能的影响，本研究使用V-ATPase活性检测试剂盒进行检测，结果发现转染Vector、LASS2-WT、LASS2-T332A、LASS2-S341A、LASS2-T346A、LASS2-S348A和LASS2-S349A的PC-3M-1E8细胞的光密度值分别为0.136 7±0.005 0、0.124 6±0.003 2、0.132 0±0.001 8、0.131 0±0.006 9、0.125 5±0.004 7、0.139 3± 0.005 4和0.133 3±0.001 8；与LASS2-WT相比，LASS2-S348A会显著升高PC-3M-1E8细胞的V-ATPase活性(图 4D)，提示LASS2 348位点的丝氨酸残基的磷酸化对于LASS2抑制V-ATPase活性非常重要。
其次，本研究进一步采用pH敏感的荧光探针BCECF/AM检测细胞外H+浓度。转染Vector、LASS2-WT、LASS2-T332A、LASS2-S341A、LASS2-T346A、LASS2-S348A和LASS2-S349A的PC-3M-1E8细胞中BCECF/AM的荧光密度分别为1.102 7± 0.017 6、0.775 9±0.004 2、0.862 9±0.014 4、0.694 6± 0.010 0、0.716 1±0.005 8、0.833 8±0.004 5和0.757 3±0.004 0；与LASS2-WT相比，LASS2-T332A和LASS2-S348A会显著升高PC-3M-1E8细胞的细胞外H+浓度(图 4E)，提示LASS2 348位点的丝氨酸残基的磷酸化对于LASS2抑制V-ATPase活性从而降低细胞外H+浓度至关重要。
最后，本研究还通过明胶酶谱法检测发现转染Vector、LASS2-WT、LASS2-S348A和LASS2-S349A的PC-3M-1E8细胞上清液中MMP-9活性差异没有统计学意义，但LASS2-S348A过表达组细胞MMP-2活性比LASS2-WT组约高5倍(图 4F)，提示LASS2第348位点的丝氨酸残基磷酸化对于LASS2抑制MMP-2活性非常关键。

2.5 蛋白磷酸酶抑制剂calyculin A明显抑制前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭

为研究蛋白磷酸酶抑制剂calyculin A对前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响，本研究先对药物浓度进行了摸索，发现0.75 nmol/L calyculin A和2 nmol/L紫杉醇是不引起细胞形态发生明显改变的最大浓度，因此，本研究选择上述浓度的药物对前列腺癌细胞进行相应处理。
生长曲线和MTT实验结果显示，与阴性对照(DMSO)相比，calyculin A或紫杉醇(阳性对照)处理第4天时对PC-3M-1E8细胞产生显著的生长抑制作用(图 5A和5B)。细胞划痕实验结果显示，DMSO、calyculin A或紫杉醇处理PC-3M-1E8细胞24 h后，细胞划痕的修复率分别为48.37%±10.56%、42.07%±13.90%、34.14%±4.76%；与阴性对照相比，calyculin A或紫杉醇会显著降低PC-3M-1E8细胞的迁移能力(图 5C)。Transwell侵袭实验显示，DMSO、calyculin A或紫杉醇处理后，细胞在16 h内穿过基底胶的细胞数分别为559.00±29.55、423.67±12.06、202.67±14.57；与阴性对照相比，calyculin A或紫杉醇会显著抑制PC-3M-1E8细胞的侵袭能力(图 5D)。总之，蛋白磷酸酶抑制剂calyculin A能抑制侵袭性前列腺癌细胞PC-3M-1E8的增殖、迁移和侵袭能力。
图5 Calyculin A或紫杉醇对前列腺癌细胞系PC-3M-1E8细胞增殖、迁移和侵袭的影响

Figure 5 Effects of calyculin A or taxol on proliferation, migration, and invasion of prostate cancer cell line PC-3M-1E8

A, growth curve assay; B, MTT test; C, cell migration experiment (n=8); D, cell invasion experiment (n=3). Dimethyl sulfoxide (DMSO) was the negative control. These figures showed that calyculin A significantly inhibits the proliferation, migration, and invasion of PC-3M-1E8 cells. *P < 0.05, * * *P < 0.001, vs. LASS2-WT.

3 讨论

本研究通过对90例前列腺癌患者的癌组织进行组织芯片免疫组织化学染色后发现，前列腺癌组织中LASS2蛋白表达水平与前列腺癌Gleason评分呈负相关，与本实验室前期研究一致，即在高转移潜能前列腺癌细胞PC-3M-1E8中LASS2蛋白的表达明显弱于低转移潜能前列腺癌细胞PC-3M-2B4[3, 14]，提示LASS2可能是一种潜在的判断前列腺癌预后的标志物。
文献表明，LASS2的神经酰胺合成酶活性受到翻译后修饰，包括糖基化和磷酸化[8]。本研究通过免疫共沉淀串联质谱分析发现LASS2的C末端存在3个丝氨酸磷酸化位点(Ser-341、Ser-348和Ser-349)，与本研究一致的是Sassa等[8]曾发现CERS2(即LASS2)的C末端区域存在多个磷酸化位点，且LASS2磷酸化对于其催化活性非常重要，因为哺乳动物LASS2蛋白的C末端区域暴露于内质网的细胞质侧，便于通过磷酸化修饰以调控LASS2的生物学活性。
本研究还发现LASS2 S348位点的去磷酸化突变体(LASS2-S348A)能显著增强前列腺癌细胞的增殖能力、锚着不依赖生长能力、细胞迁移能力和侵袭能力，并显著降低S期比例和细胞凋亡率。Zhang等[7, 19]发现LASS2-S248A通过提高ATP6V0C蛋白的表达以促进前列腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭和转移。而本研究发现LASS2-S348A并不影响ATP6V0C蛋白的表达，但会明显抑制LASS2与ATP6V0C的结合能力，进而显著增强V-ATPase活性和细胞外H+浓度，并最终促进MMP-2的活性，这些抑癌作用的差异可能与LASS2不同的磷酸化位点有关。
由于LASS2磷酸化在抑制前列腺癌侵袭和转移中发挥着重要作用，因此，本研究探索了蛋白磷酸酶抑制剂calyculin A能否抑制前列腺癌细胞的增殖和侵袭。calyculin A是一种强效的丝氨酸-苏氨酸蛋白磷酸酶抑制剂，可抑制蛋白磷酸酶1和2A，联合使用calyculin A和唑来膦酸可以抑制耐药性前列腺癌细胞的存活能力并诱导其凋亡[20]。本研究中，虽然calyculin A对侵袭性前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用弱于紫杉醇，但其确有一定的抑癌作用，而且我们采用的Calyculins A浓度相对较低(0.75 nmol/L)，因此，蛋白磷酸酶抑制剂有望作为侵袭性前列腺癌的潜在治疗药物。
综上所述，本研究结果表明，LASS2蛋白C末端S348位点的磷酸化对于LASS2的肿瘤抑制功能至关重要，其分子机制可能是LASS2 S348位点的磷酸化通过增强其与ATP6V0C的结合而抑制V-ATPase活性，进而降低细胞外H+浓度和抑制MMP-2的活性，并最终抑制前列腺癌细胞的侵袭。蛋白磷酸酶抑制剂calyculin A有望成为侵袭性前列腺癌潜在的治疗药物。

利益冲突：  所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：  裴斐构思并指导本篇论著；裴斐和刘艳华设计研究方案并撰写论文；刘艳华完成部分实验并分析、整理数据；戴志豪完成部分细胞功能学实验并分析整理数据；陆敏、张宽根、武睿和梅放完成临床病例等相关数据的收集、分析和整理；赵旭阳和由江峰提供了质谱和细胞功能学实验技术支持。所有作者均参与论文修改，并对最终文稿进行审读和确认。

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