患者感染乙型肝炎病毒后可处于不同的免疫状态，临床上通常根据丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)及感染者症状及体征将其分为乙型肝炎携带者和乙型肝炎患者，前者ALT多正常，后者ALT多为正常上限2倍及以上[1-2]。乙型肝炎病毒分为许多亚型，在我国以B型和C型居多，相对于B型，C型乙型肝炎更容易进展为肝硬化和肝癌[3]。机体免疫功能失衡在乙型肝炎发生发展中是重要的环节，乙型肝炎患者Th17、Treg细胞及其比率的变化是目前研究的热点之一[4-5]。本研究探讨B/C基因型的乙型肝炎病毒在不同ALT状态下对Th17、Treg细胞及其比率的影响，从免疫学角度进一步阐明临床以ALT分组诊治患者的理论意义。
1 资料与方法
1.1 病例选择
选择2023年1月至12月在兰州大学第一医院确诊为乙型肝炎的患者的病例资料进行回顾性分析，共入选患者220例，男162例，女58例，年龄18~60岁。同时排除急性乙型肝炎患者、中度和重度脂肪肝患者、酒精肝患者、自身免疫性肝损伤患者、药物性肝损伤患者、曾经接受过抗病毒治疗的患者、合并其他肝炎感染的患者，以及并发其他心血管、肾等重大脏器病变患者。本研究开始前已经兰州大学第一医院伦理委员会审查批准(LDYYLL2023-346)。
1.2 仪器
荧光定量PCR分析仪购自德国Lightcycler ROCH公司，流式细胞仪(FACS Calibur)及配套试剂购自美国BD公司，AU400型全自动生化分析仪购自日本OLYMPUS公司。
1.3 方法
1.3.1 乙肝病毒表面标志物的定量检测
采集患者空腹静脉血并分离血清，按罗氏Cobas e 601化学发光免疫分析仪的操作步骤进行定标及样本检测。
1.3.2 乙肝病毒DNA检测
采集患者空腹静脉血并分离血清，按乙肝病毒DNA定量检测试剂盒和基因扩增仪的操作步骤进行检测。
1.3.3 乙肝病毒基因型检测
采集患者空腹静脉血并分离血清，利用ABI 377基因分析测序仪进行基因型分析。
1.3.4 外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC) 的分离及培养
采集研究对象空腹外周血，肝素抗凝，以磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline, PBS)等体积稀释后，应用聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法分离出外周血中单个核细胞, 用含10%(体积分数)标准胎牛血清的RPMI1640培养液重悬细胞得到1×106/mL。向PBMC悬液加入佛波酯(12.5 mg/L)、离子霉素(0.25 g/L)、布雷菲德霉素A(0.75 g/L)、莫能霉素(0.35 g/L)后于37.0 ℃ 5%(体积分数)CO2浓度培养箱中放置并培养4 h。
1.3.5 外周血Th17细胞检测
取培养后的细胞悬液100 μL，加入CD3抗体10 μL和CD8抗体10 μL进行细胞表面染色，于4 ℃避光孵育30 min。加300 μL PBS洗涤，混匀低速离心5 min(1 500 r/min)弃上清液，然后加入100 μL固定液固定洗涤，于4 ℃避光孵育30 min，接着加入300 μL PBS，混匀低速离心5 min(1 500 r/min)弃上清液，再加入100 μL破膜液进行破膜洗涤，接着加入IL-17抗体10 μL进行细胞内染色，于4 ℃避光孵育30 min，加入300 μL PBS洗涤，混匀低速离心5 min(1 500 r/min)弃上清液，最后加入PBS 300μL混匀细胞。用流式细胞仪(美国BD Biosciences流式细胞仪)对CD3+CD8-IL-17+T细胞进行检测。
1.3.6 外周血Treg细胞检测
取培养后的细胞悬液100 μL，加入CD4抗体10 μL和CD25抗体10 μL，进行细胞表面染色，于4 ℃避光孵育30 min后，加300 μL PBS洗涤，混匀低速离心5 min(1 500 r/min)弃上清液，加100 μL固定液固定洗涤，于4 ℃避光孵育30 min后加入300 μL PBS，混匀低速离心5 min(1 500 r/min)弃上清液，再加入100 μL破膜液进行破膜洗涤，加入Foxp3抗体10 μL进行细胞内染色，于4 ℃避光孵育30 min，加入300 μL PBS洗涤，混匀低速离心5 min(1 500 r/min)弃上清液，最后加入PBS 300 μL混匀细胞。用流式细胞仪(美国BD Biosciences流式细胞仪)对CD4+CD25+Foxp3+T细胞进行检测。
1.4 统计学分析
采用SPSS26.0软件，计量资料经正态性检验，符合正态分布, 以均数±标准差表示。两组间均数比较采用独立样本的t检验，两组变量密切程度的分析采用Pearson相关分析，双侧检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 总人群中Th17、Treg细胞及其比率与ALT值的相关性分析
总人群中Th17、Treg细胞及其比率与ALT值的相关性分析发现，随着ALT的升高，Th17、Treg细胞及其比率均明显升高，ALT与三者之间有明显的正向相关性，相关系数分别为0.808、0.749、0.717，均具有统计学意义(P＜0.001)。
2.2 ALT正常组中不同基因型的乙型肝炎病毒对Th17、Treg细胞及其比率的影响
在ALT正常组中不同基因型的乙型肝炎病毒对Th17、Treg细胞及其比率的影响差异无统计学意义(表 1)。
表1 ALT正常组中不同基因型的乙型肝炎病毒对Th17、Treg细胞及其比率的影响Table 1 Effects of different genotypes hepatitis B virus (HBV) on Th17 and Treg cells and their ratios in the normal alanine aminotransferase (ALT) group |
| Items | B type | C type | t | P |
| n | 35 | 38 | ||
| HBV DNA | 5.097±1.116 | 5.279±1.299 | -0.637 | 0.526 |
| Th17/% | 1.818±0.112 | 1.832±0.123 | -0.491 | 0.625 |
| Treg/% | 4.865±0.196 | 4.918±0.168 | -1.242 | 0.218 |
| Th17/Treg | 0.374±0.026 | 0.373±0.02 | -0.206 | 0.837 |
n=73. |
2.3 ALT大于正常上限且小于正常上限2倍组中不同基因型的乙型肝炎病毒对Th17、Treg细胞及其比率的影响
ALT大于正常上限且小于正常上限2倍组中不同基因型的乙型肝炎病毒对Th17、Treg细胞及其比率的影响差异无统计学意义(表 2)。
表2 ALT高于正常上限且小于正常上限2倍组中，不同基因型的乙型肝炎病毒对Th17、Treg细胞及其比率的影响Table 2 Effects of different genotypes hepatitis B virus (HBV) on Th17 and Treg cells and their ratios in the alanine aminotransferase (ALT) < 2 times the normal upper limit group (the ALT>normal upper limit) |
| Items | B type | C type | t | P |
| n | 37 | 35 | ||
| HBV DNA | 5.330±1.139 | 5.247±1.260 | 0.290 | 0.773 |
| Th17/% | 2.560±0.347 | 2.525±0.348 | 0.426 | 0.671 |
| Treg/% | 5.501±0.404 | 5.513±0.356 | -0.134 | 0.893 |
| Th17/Treg | 0.468±0.073 | 0.461±0.074 | 0.435 | 0.665 |
n=72. |
2.4 ALT≥2倍上限组中不同基因型的乙型肝炎病毒对Th17、Treg细胞及其比率的影响
在ALT≥2倍上限组中不同基因型的乙型肝炎病毒对Th17、Treg细胞及其比率的影响有显著性差别，C型基因型较B型基因型的乙型肝炎患者Th17、Treg细胞及其比率均明显增高(P < 0.05，表 3)。
表3 ALT≥2倍上限组中不同基因型的乙型肝炎病毒对Th17、Treg细胞及其比率的影响Table 3 Effects of different genotypes hepatiti B virus (HBV) on Th17 and Treg cells and their ratios in the alanine aminotransferase (ALT) ≥ 2 fold upper limit group |
| Items | B type | C type | t | P |
| n | 38 | 37 | ||
| HBV DNA | 5.331±1.190 | 5.451±1.145 | -0.445 | 0.658 |
| Th17/% | 3.970±0.537 | 4.718±0.591 | -5.733 | ＜0.001 |
| Treg/% | 5.967±0.320 | 6.543±0.416 | -6.724 | ＜0.001 |
| Th17/Treg | 0.667±0.095 | 0.724±0.102 | -2.506 | 0.014 |
n=75. |
3 讨论
乙型肝炎是由乙型肝炎病毒引起的以肝脏病变为主的传染病[6]。乙型肝炎病毒在我国广为流行，严重影响着国人的健康与生活质量[7]。乙型肝炎病毒感染人体后可处于不同的免疫阶段，即乙型肝炎携带者和乙型肝炎患者。乙型肝炎携带者通常转氨酶正常或轻度增高，肝活检肝组织大多正常或有轻度肝纤维化，临床上对这期患者多以观察为主，以防病情演变。而乙型肝炎患者肝功能大多异常，特别是ALT大多大于等于2倍正常上限，肝活检可见有肝纤维化，甚至肝硬化的表现，对这期患者若不及时治疗，病情可进展为肝硬化甚至肝癌[8-9]。病理性免疫损伤在慢性乙型肝炎的发生发展中起着重要的作用。既往研究表明，与同属CD4+ T细胞亚群的Th17、Treg细胞和慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染有关，故Th17 /Treg的失衡与慢性乙型肝炎患者病情发展及病毒清除关系更为密切[10-11]。Th17细胞作为典型的促炎细胞，在HBV感染患者中，促进炎症反应及肝细胞损伤，Treg细胞在免疫调节中主要起抑制免疫作用，在HBV感染后免疫应答中Treg细胞主要是抑制机体清除病毒防止免疫应答过于激烈，无论是Th17还是Treg细胞，在病情的进展过程中，常相互制约共同发挥作用，而Th17/Treg比值常维持在一定范围内，平衡这两者关系，既能有效地清除病毒，又不至于免疫应答过于激烈。本课题组既往研究中已发现在不同ALT状态下，不同载量的乙型肝炎病毒对Th17、Treg细胞及其比率的影响是不同的，从而揭露出在不同免疫状态下乙型肝炎病毒对机体的免疫损伤不同[12]，但是目前鲜见文献探讨不同基因型的乙型肝炎病毒对Th17、Treg细胞及其比率的影响，本课题组就此进行探讨，为精准治疗提供实验依据。
本研究探讨了总人群中ALT与Th17、Treg细胞及其比率的相关性，结果显示随着ALT的升高，Th17、Treg细胞及其比率均明显升高，差异有统计学意义。乙型肝炎的发生发展与炎症及病理性免疫反应密切相关。在机体处于免疫耐受状态时，Th17细胞对病毒清除并不激烈，机体与病毒处于相互平衡状态，而与之相对应的Treg细胞也不是很高，Th17/Treg比值增高也不明显，同时ALT也大多正常或轻微增高。而在免疫应答阶段，机体识别并清除病毒，表现为Th17细胞明显增加，而为了减缓这种免疫损伤，Treg细胞也随之增加。同时Th17/Treg细胞也随之增加，表明机体在此时的免疫反应以清除病毒为主[13-14]。同时此时ALT也为正常上限2倍及以上。
本研究重点讨论了B/C基因型的乙型肝炎病毒对Th17、Treg细胞及其比率的影响，结果显示在不同的ALT状态下，B/C基因型的乙型肝炎病毒对Th17、Treg细胞及其比率的影响是不同的，在ALT正常或轻度增高的状态下，B/C基因型的乙型肝炎病毒对Th17、Treg细胞及其比率的影响差异无统计学意义，而在ALT≥2倍上限组中不同基因型的乙型肝炎病毒对Th17、Treg细胞及其比率的影响有显著差别，C基因型较B基因型的乙型肝炎患者Th17、Treg细胞及其比率均明显增高，差异有统计学意义。乙型肝炎病毒为DNA病毒。基因组是双链、环形、不完全闭合DNA，其有四个部分重叠的开放读框区，为S、C、P和X基因区，分别编码外膜蛋白HBsAg、核壳蛋白HBcAg /HBeAg、DNA聚合酶和HBxAg。根据HBV全基因序列差异≥8%，或S基因序列差异≥4%，将HBV分为A~J十种基因型，我国主要基因型为C型和B型[15-16]。据文献报道，相对于B型，C型乙型肝炎被称为难治性乙型肝炎，C型乙型肝炎病毒更难清除，更难发生HBeAg转换，HBsAg更难清除，C型乙型肝炎更难发生病毒应答和血清学应答，更容易进展为肝纤维化、肝硬化甚至肝癌[17-18]。在免疫耐受阶段，乙型肝炎病毒与机体相互适应，无明显的免疫应答，此时尽管乙型肝炎病毒基因型不同，但病毒对机体的免疫损伤无明显差别，此时ALT也大多正常或轻度增高。而在免疫应答阶段，机体对乙型肝炎病毒发生了明显的免疫反应，此时C型基因型较B型基因型的乙型肝炎患者Th17、Treg细胞及其比率均明显增高，Th17对机体的免疫反应增强，机体对病毒的病理性免疫反应增强，机体为了平衡这种免疫应答，Treg细胞数量也明显增多，而Th17/Treg细胞比值明显增加，反映此时机体对病毒以免疫清除能力为主，机体也表现为免疫损伤。本研究从Th17、Treg细胞的角度阐明相对于B型，C型乙型肝炎被称为“难治性乙型肝炎”, 此时ALT也大多明显增高。
综上所述，在不同ALT状态下，B/C基因型的乙型肝炎病毒对机体的损伤不同，所以在不同ALT状态下，乙型肝炎病毒对机体的损伤机制可能是不同的，可以为临床精准治疗提供理论依据。