基于以上情况，本研究回顾性总结口腔黏膜PV患者的临床资料，系统评估DIF的表现特征和诊断价值，并与临床表现、组织病理学特征、血清ELISA检测进行比较，明确各诊断方法的价值及相互关系，旨在为临床实践提供可靠的诊断依据。
1 资料与方法
1.1 临床资料
本研究纳入2023—2024年就诊于北京大学口腔医院，临床印象为天疱疮的患者。纳入标准：(1)临床表现为尼氏征阳性的口腔黏膜糜烂或溃疡；(2)有完整的组织病理学检查、DIF检测、临床症状记录。排除标准：(1)患有其他系统性疾病；(2)合并其他严重自身免疫性疾病；(3)具有头颈部放疗史。临床资料的收集包括患者性别、年龄、病损部位、病程及活组织检查前用药情况。本研究经北京大学口腔医院生物医学伦理委员会审核批准(批准号：PKUSSIRB-2025114171)。
1.2 活体组织取材
1.3 DIF检测
5 μm厚度冰冻切片经丙酮固定10 min后，分别滴加山羊抗人免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)、山羊抗人IgM、山羊抗人IgA、兔抗人补体C3及兔抗人纤维蛋白原(均为上海基因科技产品，1 ∶ 50稀释，货号分别为：GF020229、GF020329、GF020429、GF020129、GF011129)，37 ℃湿盒孵育30 min，磷酸盐缓冲液洗片，封片。结果判读标准：上皮细胞间见翠绿色网状荧光，或松解的天疱疮细胞(Tzanck细胞)的细胞膜周围见翠绿色荧光环，则判读为阳性。
1.4 ELISA检测
收集患者病历资料中记录的ELISA检测结果，包括血清中抗Dsg1和抗Dsg3抗体的含量。ELISA检测采用欧蒙医学诊断(中国)有限公司抗Dsg1抗体、抗Dsg3抗体检测试剂盒(货号：EA_1495-4801_G、EA_1496-4801_G)，并严格按试剂盒说明书进行操作。结果判读标准：(1)抗Dsg1抗体水平>20 U/mL为阳性，14~20 U/mL为不确定， < 14 U/mL为阴性；(2)抗Dsg3抗体水平>20 U/mL为阳性，7~20 U/mL为不确定， < 7 U/mL为阴性。
1.5 统计学方法
采用SPSS 24.0统计软件进行数据分析。计量资料若呈正态分布则以${\bar x}$±s表示，若呈偏态分布则以M(P25, P75)表示；计数资料以n(%)表示。通过四格表法计算各项诊断指标的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、漏诊率及误诊率。采用受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线评估DIF、组织病理学、ELISA与临床诊断对口腔黏膜PV的诊断效能，计算曲线下面积(area under curve，AUC)并进行组间比较。对于配对分类资料诊断一致性的比较，采用McNemar检验。P < 0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 临床资料
本研究共收集临床表现印象为口腔黏膜PV的患者73例，依据诊断标准[8, 10]，最终有53例(72.6%)患者被纳入研究，其中包括女性31例(58.49%)，男性22例(41.51%)。患者发病年龄以30~60岁为主，占全部病例的62.26%；病变部位以颊部黏膜最为常见(58.49%)，其次为牙龈(26.42%)、舌部(9.43%)及唇部(5.66%)；30例患者(56.60%)伴有口腔黏膜起疱史，14例(26.42%)伴有皮肤疱性症状。在病程分布上，患者的病程为0.5~108个月，中位病程为5(2，12)个月，病程在1年内的患者占81.13%，病程1~4年的患者占9.43%，此外，还有9.43%的患者病程超过4年。38例(71.70%)确诊患者有药物治疗史，但仅42.11%(16/38)用药后缓解。
2.2 组织病理特征
53例患者中，组织病理学检查显示50例(94.34%)呈现典型的病理改变，表现为棘层松解、上皮内疱形成。疱主要位于基底层和棘层之间，基底细胞附着于基底膜，呈“墓碑样”排列; 松解的棘层细胞单个或成簇的游离于疱液中，即经典的天疱疮细胞; 部分病例因为疱壁脱落，虽无法观察到完整棘层细胞，但仍可观察到基底细胞位于基底膜; 固有层内可见程度不等的慢性炎细胞浸润(图 1)。其余3例患者病理表现不典型，镜下均表现为黏膜轻度慢性炎，未见确切的上皮内疱的形成。
图1 口腔黏膜寻常型天疱疮的组织病理学特征(HE染色)Figure 1 Histopathological features of oral mucosal pemphigus vulgaris (HE staining) A, intraepithelial blister formation (×20); B, acantholysis (×40); C, blister roof detachment, with epithelial basal cells attached to the surface of connective tissue papillae showing a villous appearance (×100); D, acantholysis with scattered Tzanck cells: swollen round cells with hyperchromatic nuclei, often surrounded by a perinuclear cytoplasmic halo (×200). HE, hematoxylin-eosin. |
2.3 DIF检测结果
图2 口腔黏膜寻常型天疱疮的直接免疫荧光表现Figure 2 Direct immunofluorescence of oral mucosal pemphigus vulgaris A, a reticular pattern of IgG deposition is observed in the intercellular spaces of the epithelial stratum spinosum (excitation wavelength 488 nm, emission wavelength 520-530 nm, ×400); B, a reticular pattern of C3 deposition is observed in the intercellular spaces of the epithelial stratum spinosum (excitation wavelength 488 nm, emission wavelength 520-530 nm, ×200). |
表1 2例直接免疫荧光结果阴性患者的诊断及治疗情况Table 1 Diagnosis and treatment status of 2 patients with negative direct immunofluorescence results |
| Patient | Diagnosis | Treatment | |||||
| Clinical manifestation | Histopathology | Antibody level by ELISA/(U/mL) | Treated with pemphigus protocol | Used glucocorticoids | Treatment outcome | ||
| No.1 | Typical | Atypical | Anti-Dsg3: 93.70 (>20) Anti-Dsg1: 0 (< 20) | Yes | Yes | Marked | |
| No.2 | Typical | Atypical | Anti-Dsg3: 58.44 (>20) Anti-Dsg1: 11.33 (< 20) | Yes | No | Mild | |
ELISA, enzyme-linked immunosorbnent assay. |
2.4 ELISA检测结果
53例确诊PV的患者中，有46例进行了血清学抗Dsg1和抗Dsg3抗体检测，其中38例(82.61%) 表达为阳性，包括抗Dsg1抗体阳性18例(39.13%)、抗Dsg3抗体阳性36例(78.26%)、抗Dsg1和抗Dsg3抗体同时阳性14例(30.43%)。
2.5 DIF的诊断效能评估
表2 直接免疫荧光各抗体指标的诊断效能Table 2 Diagnostic performance of various direct immunofluorescence antibody indicators |
| Detection indicator | Sensitivity | Specificity | Positive predictive value | Negative predictive value | Missed diagnosis rate | False positive rate |
| IgG | 92.45% | 55.00% | 84.48% | 73.33% | 7.55% | 45.00% |
| C3 | 52.83% | 60.00% | 77.78% | 32.43% | 47.17% | 40.00% |
| Fibrinogen | 20.75% | 75.00% | 68.75% | 26.32% | 79.25% | 25.00% |
| IgA | 5.66% | 85.00% | 50.00% | 25.37% | 94.34% | 15.00% |
| IgM | 1.89% | 95.00% | 50.00% | 26.76% | 98.11% | 5.00% |
| DIF | 96.23% | 100.00% | 100.00% | 90.91% | 3.77% | 0.00% |
Ig, immunoglobulin; C3, complement 3; DIF, direct immunofluorescence. |
2.6 不同检测方法诊断效能的比较
如表 3所示，不同检测方法中DIF的诊断价值最高，灵敏度为96.23%，特异度为100.00%，AUC值达0.981；组织病理学次之，灵敏度为94.34%，特异度为100.00%，AUC值为0.972；ELISA检测的灵敏度为82.61%，特异度为82.35%，AUC值为0.825；此外，虽然临床诊断的灵敏度可达86.79%，但其特异度比较低，仅为15.00%，AUC值也只有0.509。McNemar检验结果显示，DIF与组织病理学(P>0.999)、临床诊断(P=0.180)、ELISA检测(P=0.109)之间的灵敏度差异均无统计学意义。
表3 口腔黏膜天疱疮中不同检测方法诊断效能的比较Table 3 Comparison of diagnostic performance of different detection methods in oral mucosal pemphigus vulgaris |
| Detection method | Sensitivity | Specificity | AUC |
| DIF | 96.23% | 100.00% | 0.981 |
| Histopathology | 94.34% | 100.00% | 0.972 |
| ELISA | 82.61% | 82.35% | 0.825 |
| Clinical diagnosis | 86.79% | 15.00% | 0.509 |
DIF, direct immunofluorescence; ELISA, enzyme-linked immunosorbnent assay; AUC, area under curve. |
3 讨论
3.1 DIF在口腔黏膜PV中的特征和诊断价值
本研究通过回顾性分析53例口腔黏膜PV患者的临床资料、组织学特征、DIF特征及ELISA结果，系统评估了DIF在口腔黏膜PV诊断中的核心价值，并与其他三种诊断方法进行了比较。本研究数据显示，应用DIF诊断口腔黏膜PV的灵敏度为96.23%，特异度为100.00%，AUC值为0.981，表明DIF对于诊断口腔黏膜PV具有极高的效能，主要表现为上皮棘细胞间特征性网状荧光沉积，这是由于自身免疫复合物在上皮细胞间沉积，从而使得DIF具有高特异性。此外，DIF的假阴性率仅为3.77%，这可能与活组织检查部位的选择或操作技术有关。因此，建议临床上行活组织检查时要选择病变周围3~10 mm看似正常的黏膜，以避免因上皮脱落而导致的假阴性结果。若临床高度怀疑PV，而DIF检测为阴性，必要时可重复进行活组织检查和DIF检测，以明确诊断，尽早行针对性的治疗，改善患者预后[9]。DIF诊断口腔黏膜PV的灵敏度未达100.00%，可能受以下因素影响[7, 11-13]：(1)活组织检查部位选择和操作技术规范：由于抗体主要沉积于病损周围正常黏膜，若取材部位为活动性糜烂区、水疱中央或陈旧性皮损处，易导致假阴性结果；此外，小口径活组织检查也易造成漏检。(2)样本处理与技术因素：组织样本保存或运输不当(误用甲醛溶液，未使用Michel溶液或生理盐水，室温或冷藏保存超时等)均可致抗原降解；同时，检测试剂过期，染色流程操作不规范等技术环节问题也会降低检测灵敏度。(3)临床治疗影响：治疗可降低抗体水平，从而影响DIF检测结果。因此，在临床应用中需严格规范活组织检查操作流程，优化样本处理标准，并结合患者治疗史进行综合评估，以尽可能降低DIF假阴性风险，提高其灵敏度。
在DIF的5项免疫指标中，IgG阳性率最高(92.45%)，是口腔黏膜PV中最主要的自身抗体亚类，表明其是PV最核心的诊断指标。此外，补体C3阳性率为52.83%，提示补体原位激活参与此疾病的发生[14]。同时，本研究还发现IgG与C3之间存在很强的相关性，IgG和C3的联合使用与5个指标的组合使用在诊断口腔黏膜PV时的阳性率(96.23%)是一致的。因此，可以优先考虑联合检测IgG和C3，这和先前的研究结果也具有一致性[15]。纤维蛋白原在基底膜区呈线性沉积，阳性率为20.75%。值得注意的是，本研究中IgA(5.66%)和IgM(1.89%)阳性率较低，提示PV是由IgG自身抗体介导的，若DIF检测仅显示出IgM或IgA沉积，则需与其他类型的自身免疫性大疱性疾病相鉴别。临床上，口腔黏膜出现糜烂或水疱的疾病种类繁多，如黏膜类天疱疮、扁平苔藓、多形性红斑及线状IgA病等。这些疾病的DIF检测的表现与口腔黏膜PV显著不同，黏膜类天疱疮主要表现为基底膜区线状IgG、C3或IgA沉积，扁平苔藓可见基底膜区线状IgG和C3沉积及表皮层内胶样小体，而线状IgA病则表现为基底膜区线状IgA沉积[5, 15-16]。本研究中口腔黏膜PV的DIF特征是上皮棘层细胞间网状IgG或C3沉积，可与其他自身免疫性大疱性疾病相鉴别。
3.2 DIF与其他诊断方法的综合分析
本研究中，组织病理诊断的灵敏度为94.34%，与DIF检测结果(96.23%)接近，但由于其诊断主要依赖于典型的棘层松解和上皮内疱形成，而口腔黏膜病损又常以薄壁水疱为特征，容易破裂，表现为非特异性的糜烂，从而导致组织病理学检查出现假阴性[17]。本研究发现，部分组织病理学特征不典型的病例可以通过DIF检测明确诊断，这表明在口腔黏膜PV的诊断中DIF与组织病理学具有互补性，组织病理学侧重于形态学观察，而DIF聚焦于免疫学检测。联合应用两种方法可通过形态-免疫学双重证据链，提高诊断的准确性，特别是对于早期或不典型的口腔黏膜PV患者，可以避免漏诊或误诊。
本研究中血清学ELISA检测的整体灵敏度为82.61%，低于DIF(96.23%)和组织病理学诊断(94.34%)。进一步分析显示，抗Dsg3抗体阳性率为78.26%，显著高于抗Dsg1抗体阳性率(39.13%)，这一差异与Dsg1和Dsg3在皮肤及黏膜组织中的特异性分布差异密切相关，并可直接影响其临床表现。Dsg1主要集中在表皮浅层，而Dsg3则集中分布于基底层和副基底层。口腔黏膜PV患者体内主要产生抗Dsg3自身抗体，致使抗Dsg3抗体在口腔黏膜PV中占主导地位，而抗Dsg1抗体的表达较少[3, 18]。尽管血清学ELISA检测的敏感性相对有限，但其具有无创、可重复检测的优势，使其在天疱疮的临床管理中具有不可替代的价值，可为疾病动态监测、病情评估和预后判断提供重要的依据[19-21]。此外，对于DIF检测阴性或因客观条件无法开展DIF检测的病例，ELISA检测可作为重要的辅助诊断方法。本研究中2例DIF阴性的确诊患者，通过典型的临床症状和血清学阳性结果进行了明确诊断，这也充分体现了多指标联合诊断的重要性。
本研究结果显示，临床诊断虽然具有较高的灵敏度(86.79%)，但其特异度仅为15.00%，这是由于口腔黏膜PV的临床症状缺乏特异性，水疱、糜烂、溃疡等病损表现与黏膜类天疱疮、扁平苔藓、多形性红斑等黏膜疾病存在明显的重叠，容易混淆而导致误诊[16]。因此，单纯依靠临床症状诊断口腔黏膜PV存在一定的局限性，临床上需结合DIF、组织病理学及ELISA等实验室检查进行综合诊断。
此外，作为单中心的回顾性研究，本研究也具有一定的局限性：样本量较小，且缺乏长期随访和预后数据。未来应通过多中心协作扩大样本量，结合其他转录组学、蛋白组学等分子生物学技术，深入探究DIF荧光模式与疾病临床亚型、严重程度、活动度及治疗反应的内在关联，为口腔黏膜PV的精准诊疗提供更加全面的理论依据。
综上，DIF在口腔黏膜PV诊断中具有极高的灵敏度和特异度，可作为该自身免疫性疾病诊断的核心指标。在临床实践中，建议采用多模态诊断策略，以典型临床表现作为初筛依据，DIF检测作为核心确诊手段，联合组织病理学提供形态学证据，并辅以ELISA检测进行抗体定量分析，从而构建“临床表现-DIF-组织病理学-ELISA”口腔黏膜PV综合诊断流程。这一综合诊断体系不仅能显著提高口腔黏膜PV诊断的准确性，更能为患者个体化治疗方案的制定提供理论基础。