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北京大学学报（医学版） >

2024 , Vol. 56 >Issue 3: 487 - 494

DOI: https://doi.org/10.19723/j.issn.1671-167X.2024.03.016

论著

熊果酸改善精神分裂症小鼠脱髓鞘和脑组织间液引流紊乱

  • 龙仁 1 ,
  • 毛鑫 2 ,
  • 高天姿 1 ,
  • 解倩 3 ,
  • 谈瀚博 1 ,
  • 李子寅 1 ,
  • 韩鸿宾 , 1, 2, * ,
  • 袁兰 , 1, *
展开
  • 1. 北京大学医学技术研究院医学影像技术学系，北京市磁共振成像设备与技术重点实验室，北京 100191
  • 2. 北京大学第三医院放射科，北京 100191
  • 3. 北京大学第三医院肾内科，北京 100191

收稿日期: 2023-04-20

  网络出版日期: 2024-06-12

基金资助

国家自然科学基金(62394310)

国家自然科学基金(62394312)

国家自然科学基金(62394314)

版权

版权所有，未经授权。
收起

Ursolic acid improved demyelination and interstitial fluid drainage disorders in schizophrenia mice

  • Ren LONG 1 ,
  • Xin MAO 2 ,
  • Tianzi GAO 1 ,
  • Qian XIE 3 ,
  • Hanbo TAN 1 ,
  • Ziyin LI 1 ,
  • Hongbin HAN , 1, 2, * ,
  • Lan YUAN , 1, *
Expand
  • 1. Department of Medical Imaging Technology, Institute of Medical Technology, Peking University & Beijing Key Lab of Magnetic Resonance Imaging Device and Technique, Beijing 100191, China
  • 2. Department of Radiology, Peking Univer-sity Third Hispital, Beijing 100191, China
  • 3. Department of Nephrology, Peking Univer-sity Third Hispital, Beijing 100191, China
HAN Hongbin, e-mail,
YUAN Lan, e-mail,

Received date: 2023-04-20

  Online published: 2024-06-12

Supported by

the National Natural Science Foundation of China(62394310)

the National Natural Science Foundation of China(62394312)

the National Natural Science Foundation of China(62394314)

Copyright

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Fold

摘要

目的: 探讨精神分裂症(schizophrenia, SZ)的髓鞘和脑组织间液(interstitial fluid, ISF)相关发病机制，探究熊果酸(ursolic acid, UA)对SZ中髓鞘损伤及其继发的ISF异常引流的治疗效果。方法: 使用30只6~8周雌性C57BL/6J小鼠，体质量(20±2) g，随机分为UA治疗组、SZ模型组、对照组3组，每组10只：(1)对照组：腹腔注射(intraperitoneal injection, ip)生理盐水，灌胃(intragastric, ig)给予1%(质量分数)羧甲基纤维素钠(carboxymethylcellulose sodium, CMC-Na)；(2)SZ模型组：ip给与2 mg/kg的地卓西平(dizocilpine maleate，MK-801)，ig给与1% (质量分数)CMC-Na；(3)UA治疗组：ig给与25 mg/kg的UA，ip给与2 mg/kg的MK-801。治疗组先ig给药UA预治疗一周，然后对3组小鼠进行为期两周的药物干预。在造模完成后依次通过旷场测试和前脉冲抑制实验对小鼠进行行为学评价。行为测试后，通过向脑区注射荧光示踪剂来探究各组ISF分区引流的改变；通过免疫荧光探究各组脑内水通道蛋白4(aquaporin 4, AQP4)极性分布的改变以及蛋白表达的变化；通过激光共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope, LSCM)髓鞘反射光成像研究鼠脑内髓鞘的变化。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)对计量数据进行组间比较，使用TukeyHSD进行组间两两比较。结果: 旷场测试发现，模型组在旷场中运动的总路程[(7 949.39±1 140.55) cm vs. (2 831.01±1 212.72) cm, P < 0.001]和中央区域停留时间[(88.43±22.06) s vs. (56.85±18.58) s, P=0.011]显著高于对照组，而治疗组在旷场中运动总路程[(2 415.80±646.95) cm vs. (7 949.39±1 140.55) cm, P < 0.001]和中央区域停留时间[(54.78±11.66) s vs. (88.43±22.06) s, P=0.007]较模型组显著降低。前脉冲抑制实验发现，模型组给与预脉冲时对震惊反射的抑制率均显著低于对照组(P均 < 0.001)；治疗组上述指标较模型组显著增加(P均 < 0.001)。髓鞘反射光检测发现，模型组小鼠脑内存在显著的脱髓鞘，治疗组脑内脱髓鞘情况得到逆转。荧光示踪发现，模型组示踪剂向头侧皮层区的扩散面积和向尾侧丘脑区的返流面积均显著大于对照组[(13.93±3.35) mm2 vs. (2.79±0.94) mm2, P < 0.001; (2.48±0.38) mm2 vs. (0.05±0.12) mm2, P < 0.001]，且脑区间引流分区明显破坏；治疗组示踪剂向头侧皮层区的扩散面积和向尾侧丘脑区的返流面积均较模型组显著减小[(7.93±2.48) mm2 vs. (13.93±3.35) mm2, P < 0.001; (0.50±0.30) mm2 vs. (2.48±0.38) mm2, P < 0.001]。免疫荧光染色发现，模型组小鼠脑内AQP4极性分布遭到破坏，且模型组AQP4蛋白表达量较对照组明显下降[(3 663.88±733.77) μm2 vs. (13 354.92±4 054.05) μm2, P < 0.001]；治疗组较模型组AQP4极性分布得到改善，AQP4蛋白表达量较模型组显著升高[(11 104.68±3 200.04) μm2 vs. (3 663.88±733.77) μm2, P < 0.001]。结论: 一定剂量的UA干预可以改善SZ小鼠的行为学表现，这种改善表现为运动亢进和焦虑症状得到缓解，感觉运动门控功能得到恢复；其机制可能是通过改善SZ小鼠的脱髓鞘病理改变及ISF分区引流紊乱。

关键词： 精神分裂症; 脑组织间液; 脱髓鞘; 熊果酸

本文引用格式

龙仁 , 毛鑫 , 高天姿 , 解倩 , 谈瀚博 , 李子寅 , 韩鸿宾 , 袁兰 . 熊果酸改善精神分裂症小鼠脱髓鞘和脑组织间液引流紊乱[J]. 北京大学学报（医学版）, 2024 , 56(3) : 487 -494 . DOI: 10.19723/j.issn.1671-167X.2024.03.016

Abstract

Objective: To unveil the pathological changes associated with demyelination in schizophrenia (SZ) and its consequential impact on interstitial fluid (ISF) drainage, and to investigate the therapeutic efficacy of ursolic acid (UA) in treating demyelination and the ensuing abnormalities in ISF drainage in SZ. Methods: Female C57BL/6J mice, aged 6-8 weeks and weighing (20±2) g, were randomly divided into three groups: control, SZ model, and UA treatment. The control group received intraperitoneal injection (ip) of physiological saline and intragastric administration (ig) of 1% carboxymethylcellulose sodium (CMC-Na). The SZ model group was subjected to ip injection of 2 mg/kg dizocilpine maleate (MK-801) and ig administration of 1% CMC-Na. The UA treatment group underwent ig administration of 25 mg/kg UA and ip injection of 2 mg/kg MK-801. The treatment group received UA pretreatment via ig administration for one week, followed by a two-week drug intervention for all the three groups. Behavioral assessments, including the open field test and prepulse inhibition experiment, were conducted post-modeling. Subsequently, changes in the ISF partition drainage were investigated through fluorescent tracer injection into specific brain regions. Immunofluorescence analysis was employed to examine alterations in aquaporin 4 (AQP4) polarity distribution in the brain and changes in protein expression. Myelin reflex imaging using Laser Scanning Confocal Microscopy (LSCM) was utilized to study modifications in myelin within the mouse brain. Quantitative data underwent one-way ANOVA, followed by TukeyHSD for post hoc pairwise comparisons between the groups. Results: The open field test revealed a significantly longer total distance [(7 949.39±1 140.55) cm vs. (2 831.01±1 212.72) cm, P < 0.001] and increased central area duration [(88.43±22.06) s vs. (56.85±18.58) s, P=0.011] for the SZ model group compared with the controls. The UA treatment group exhibited signifi-cantly reduced total distance [(2 415.80±646.95) cm vs. (7 949.39±1 140.55) cm, P < 0.001] and increased central area duration [(54.78±11.66) s vs. (88.43±22.06) s, P=0.007] compared with the model group. Prepulse inhibition test results demonstrated a markedly lower inhibition rate of the startle reflex in the model group relative to the controls (P < 0.001 for both), with the treatment group displaying significant improvement (P < 0.001 for both). Myelin sheath analysis indicated significant demyelination in the model group, while UA treatment reversed this effect. Fluorescence tracing exhibited a significantly larger tracer diffusion area towards the rostral cortex and reflux area towards the caudal thalamus in the model group relative to the controls [(13.93±3.35) mm2 vs. (2.79±0.94) mm2, P < 0.001 for diffusion area; (2.48±0.38) mm2 vs. (0.05±0.12) mm2, P < 0.001 for reflux area], with significant impairment of drainage in brain regions. The treatment group demonstrated significantly reduced tracer diffusion and reflux areas [(7.93±2.48) mm2 vs. (13.93±3.35) mm2, P < 0.001 for diffusion area; (0.50±0.30) mm2 vs. (2.48±0.38) mm2, P < 0.001 for reflux area]. Immunofluorescence staining revealed disrupted AQP4 polarity distribution and reduced AQP4 protein expression in the model group compared with the controls [(3 663.88±733.77) μm2 vs. (13 354.92±4 054.05) μm2, P < 0.001]. The treatment group exhibited restored AQP4 polarity distribution and elevated AQP4 protein expression [(11 104.68±3 200.04) μm2 vs. (3 663.88±733.77) μm2, P < 0.001]. Conclusion: UA intervention ameliorates behavioral performance in SZ mice, Thus alleviating hyperactivity and anxiety symptoms and restoring sensorimotor gating function. The underlying mechanism may involve the improvement of demyelination and ISF drainage dysregulation in SZ mice.

Key words： Schizophrenia; Brain interstitial fluid; Demyelination; Ursolic acid

根据世界卫生组织的调查，精神分裂症(schizophrenia，SZ)是影响人类健康最严重的精神疾病之一[1]。SZ是病因不明的一组症状和体征的集合，其症状包括幻觉、思维障碍、运动亢进、焦虑，以及认知功能损害等[2]。目前针对SZ的治疗药物具有局限性，其主要改善了SZ幻觉、思维障碍等症状，对焦虑、运动亢进及认知功能损害等不能起到有效的治疗作用[3]。神经影像学研究显示，SZ患者脑内存在广泛的白质微观结构损伤[4-5]。白质纤维束的髓鞘受损不仅可以阻碍神经环路的电传导，还可以扰乱脑区组织间液(interstitial fluid, ISF)引流方向和影响引流速度，进而影响细胞外间隙内微环境稳态和神经递质的转运，导致认知等功能障碍[6-9]。以往的研究主要关注于神经元和星形胶质细胞的改变，忽略了髓鞘和脑ISF引流的病理变化，导致传统SZ的治疗并未取得实质性的进展。最新的研究表明，熊果酸(ursolic acid，UA)作为一种从植物中提取的天然小分子化合物，具有髓鞘保护作用，是以髓鞘为靶点的SZ的潜在治疗药物[10]。UA在对多发性硬化等脱髓鞘疾病的实验性治疗中已展现出明显的效果[11-12]，但UA是否对SZ中白质损伤这一病理改变存在治疗作用尚不清楚。本研究旨在发现SZ中髓鞘相关病理改变及其对ISF引流的影响，同时探究UA对SZ中髓鞘损伤及其继发的ISF引流改变的治疗效果。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope，Leica公司，德国)由北京大学医药卫生分析中心提供，旷场试验箱和轨迹追踪系统(Tracking Master V3.0)由北京大学磁共振国家重点实验室提供，震惊反射的前脉冲抑制实验系统由北京众实迪创科技发展有限公司提供，N甲基-D-天门冬氨酸非竞争性抑制剂地卓西平(dizocilpine maleate，MK-801)购自美国Sigma公司，UA购自中国Accela公司(纯度≥95%)，羧甲基纤维素钠(carboxy-methylcellulose sodium, CMC-Na)购自北京迈瑞达科技有限公司(纯度≥99.5%，黏度为800~1 200)，兔抗AQP4特异性多克隆抗体一抗购自美国proteintech公司，山羊抗兔IgG (H&L，Alexa Fluor® 488)购自英国Abcam公司，荧光示踪剂Lucifer Yellow(LY)购自美国Sigma-aldrich公司，微量进液针(10 μL)购自瑞士Hamilton公司，脑立体定位仪及微量注射泵购自美国Stoelting公司。

1.2 实验动物及分组

选择30只6~8周雌性C57BL/6J小鼠(购自斯贝福北京生物技术有限公司)，体质量(20±2) g，随机分为治疗、模型、对照3组，每组10只。在受控的实验室条件下[室温为(20±1) ℃，光/暗循环12 h]自由获取食物和水。所有行为测试均在光照阶段进行。本研究开始前已经北京大学生物医学伦理委员会实验动物护理与使用分会审查批准(LA2022325)，所有动物手术均按照中国动物福利与伦理委员会的相关指南(GB/T3589—2018)进行。
模型组(MK-801+vehicle)：在造模开始前连续灌胃(intragastric, ig)1% (质量分数)CMC-Na一周，剂量为10 mL/(kg·d)，第7天至第21天在灌胃1% CMC-Na 30 min后，腹腔注射(intraperitoneal injection, ip)MK-801造模，使用剂量为2 mg/(kg·d)，建立SZ动物模型。治疗组(MK-801+UA)：在造模开始前连续灌胃UA一周，使用剂量为25 mg/kg，在第7天至第21天灌胃UA 30 min后，腹腔注射MK-801造模。对照组(Sham+vehicle)：第1天至第7天用1% CMC-Na灌胃，第7天至第21天在灌胃1% CMC-Na 30 min后，腹腔注射生理盐水(10 mL/kg)[13]。

1.3 实验方法

1.3.1 旷场实验

造模完成后，进行旷场实验(open-field test, OFT, 设备由磁共振成像设备与技术北京市重点实验室提供)，测试前一天将小鼠放置于行为学测试实验室以适应环境，小鼠实验箱规格50 cm × 50 cm × 40 cm；在实验箱顶部正中央安装有摄像记录装置，连接到电脑端的动物行为分析软件，用于记录小鼠的运动情况。实验开始前先清洁实验箱，调节摄像头曝光到最大，将每只小鼠置于旷场设备的中心，记录并自动计算15 min内小鼠的总运动路程以及在中心区域(定义为总面积的25%)停留的时间，运动总路程反映了动物运动亢进的程度，中央区停留时间则反映了动物的焦虑水平[14]。每测完一只小鼠都清理旷场，避免气味对后续小鼠的影响，同时保证测试过程安静[15]。

1.3.2 震惊反射的前脉冲抑制实验

完成旷场实验评估后，对小鼠进行震惊反射的前脉冲抑制实验(prepulse inhibition, PPI)，评估小鼠的感觉运动门控(sensorimotor gating，SG)[16]。SG的功能损害表现为SZ患者注意集中异常和思维障碍[17]；采用Xeye Startle震惊反射试验系统进行实验(由北京众实迪创科技发展有限公司提供)，测试前一天将小鼠放置于行为学测试实验室以适应环境，实验开始前，设置实验箱背景噪声为70 dB，惊吓脉冲为120 dB，预脉冲强度分别设置为比背景噪声水平高3 dB(PPI3)、6 dB(PPI6)和12 dB(PPI12)[13]；将单次实验分为四个阶段(即Block1~4)，每个阶段依次出现，Block1和Block4由6次单独的惊吓脉冲构成；Block2和Block3则由6次单独的惊吓脉冲，5次PPI3加惊吓脉冲的刺激模式，5次PPI6加惊吓脉冲的刺激模式，5次PPI12加惊吓脉冲的刺激模式，5次白噪声无刺激的刺激模式组成；其中预脉冲持续时间20 ms，惊吓脉冲持续时间40 ms，预脉冲和惊吓脉冲起始时刻之间的时间间隔为100 ms，每种刺激模式随机出现，各模式间的时间间隔在5~23 s间随机选取[13]。实验开始时将小鼠置于透明玻璃盒中固定，让小鼠在实验箱中适应背景噪声5 min，依次进行四个阶段的实验，记录下的最大峰值振幅(mv)用于确定震惊反射的幅度，仅有惊吓脉冲的试验中的平均反应振幅为S，有预脉冲和惊吓脉冲的试验中的平均反应振幅为PPI_S，预脉冲对震惊反射幅度的抑制率(即PPI%)计算公式为：PPI%=100×(S-PPI_S)/S[13]。

1.3.3 荧光示踪实验

将小鼠腹腔注射三溴乙醇麻醉，使用剂量为240 mg/kg；切开小鼠头皮并暴露颅骨，标记前囟点，将头部水平固定到立体定位仪，以前囟点为原点，根据小鼠脑立体定位图谱，找到尾状核区位置并标记(前0.7 mm，右1.7 mm，深3.0 mm)。用颅钻在对应位置钻开颅骨，微量进液针吸取10 mmol/L的Lucifer Yellow溶液并固定到微量注射泵，设置进液量为1 μL, 进样速度为0.2 μL/min，而后使用微量进液泵进样到对应脑区。注射完毕后停针10 min，缓慢将针拔出，避免液体回流；待扩散1 h后，灌流取脑，将鼠脑取出置于4%(体积分数)多聚甲醛4 ℃固定过夜。第2天将鼠脑取出制作斜矢状脑片：将鼠脑置于切片模具，沿丘脑和尾状核的连接方向斜15°做斜矢状位切片，厚度1 mm，将观察面置于共聚焦小皿上机观察。激光扫描共聚焦显微镜拍摄条件设置：荧光示踪剂激发光波长488 nm，发射光510~550 nm；髓鞘反射激发光633 nm，发射光630~640 nm。徕卡DIVE共聚焦显微镜的拼图功能可以在扫描过程中存储m × n张图像，然后通过LSCM Merging函数将荧光图像重建获得指定区域中样品的完整图像。

1.3.4 免疫荧光组织化学染色

采用免疫荧光染色的方式研究SZ鼠脑AQP4的极性分布和蛋白表达，行为学实验后将小鼠灌流取脑，置于4%多聚甲醛4 ℃固定24 h，然后将鼠脑依次放入梯度蔗糖溶液脱水，浓度(质量分数)梯度设置为15%、20%、30%，分别过夜沉底，包埋剂冷冻包埋后使用冰冻切片机切片，切片厚度20 μm，贴片后37 ℃烤片12 h，切完后脑片放-20 ℃保存。选取尾状核区头侧皮层区域进行观察，免疫荧光染色前，先用PBS清洗3遍样品，每次5 min，使用0.5%(质量分数)PBST穿透组织30 min，使用含5%(体积分数)BSA的一抗稀释液封闭组织1 h，加入兔抗AQP4特异性多克隆抗体一抗(1 ∶ 200)，于湿盒中4 ℃过夜，室温复温1 h，PBS清洗3次，每次5 min，加入山羊抗兔IgG H&L (Alexa Fluor® 488)二抗(1 ∶ 400)，室温避光孵育1 h，PBS清洗3次，每次5 min，DAPI染液孵育5 min，漂洗5 min，擦干，封片剂封片。使用荧光共聚焦显微镜观察并拍照，每只小鼠染色三张脑片，每个脑片选取3个视野，LSCM拍摄条件设置：荧光示踪剂激发光波长488 nm，发射光510~550 nm[6]。图像采集完成后，使用LAS X(德国Leica公司)软件分析荧光区域的面积。

1.4 统计学分析

采用R(版本号：4.2.2)对实验数据进行统计分析，符合正态分布的计量资料以$\bar x \pm s$表示，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)比较组间差异，使用TukeyHSD进行组间两两比较，非正态分布计量资料以M(P25，P75)表示，采用Kruskal-Wallis秩和检验比较组间差异，使用Steel-Dwass检验进行组间两两比较，P < 0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠一般状况及体质量变化

各组小鼠按分组情况进行3周干预(图 1)，模型组和治疗组小鼠在腹腔注射MK-801 30 min后出现反应冷漠、自发活动增加及原地转圈的行为。为评估造模期间小鼠全身机能的变化，每天测量各组小鼠的体质量，以造模开始第1天的体质量为基线，计算每天的体质量与第1天的差值，比较三组小鼠间体质量变化是否存在差异。在实验第1天，三组间小鼠体质量变化差异无统计学意义(P=0.083)，实验第10天各组间小鼠体质量变化差异开始有统计学意义(P=0.020)。造模期间，对照组小鼠整体体质量上升，模型组小组整体体质量下降，反映模型组小鼠全身机能受到影响(图 2)；治疗组小鼠体质量变化介于对照组和模型组之间，反映药物治疗能改善MK-801造模导致的小鼠全身机能改变。
图1 药物干预设计的简化方案

Figure 1 Simplified schema of drug intervention design

Drug intervention lasted for a total of 21 days, with pretreatment in the first week and animal modeling in the 2 to 3 weeks. Behavioral tests were conducted after the modeling was completed. UA, ursolic acid; MK-801, dizocilpine maleate; ip, intraperitoneal injection; ig, intragastric.

图2 UA和MK-801干预对小鼠体质量的影响

Figure 2 Effect of UA and MK-801 intervention on mice body weight

Comparing the differences in weight changes among three groups using analysis of variance; n=7/group; error bar represents the standard deviation; * P < 0.05, ☆ P < 0.01. UA, ursolic acid; MK-801, dizocilpine maleate.

2.2 UA干预改善SZ小鼠焦虑和自发行为的变化

为了评价小鼠SZ模型是否造模成功，验证MK-801腹腔注射造模小鼠是否具有SZ疾病症状以及UA的治疗是否改善SZ小鼠的疾病症状，采用旷场实验检测模型小鼠的自主运动能力及焦虑抑郁情绪(图 3)，与对照组相比，模型组在旷场中运动的总路程(P < 0.001)和中央区域停留时间(P=0.011)显著增加；治疗组相比于模型组，在旷场中运动的总路程(P < 0.001)和中央区域停留时间(P=0.007)显著降低，治疗组与对照组相比，在旷场中运动的总路程(P=0.736)和中央区域停留时间(P=0.975)差异无统计学意义。
图3 UA和MK-801干预对小鼠自发活动及抑郁情绪的影响

Figure 3 Effects of UA and MK-801 interventions on spontaneous activity and depressive mood in mice

A, mice movement trajectory map; B, statistical comparison of total exercise distance; C, statistical comparison of time in open field center; n=7/group; error bar represents the standard deviation, * P < 0.05, ☆ P < 0.01, compared with Sham+vehicle group; # P < 0.01, compared with MK-801+vehicle group. UA, ursolic acid; MK-801, dizocilpine maleate.

2.3 UA干预改善SZ小鼠感觉运动门控功能

采用震惊反射的前脉冲抑制实验评估小鼠感觉运动门控功能，与对照组相比，模型组给与PPI3、PPI6、PPI12的预脉冲强度时震惊反射的抑制率(即PPI%)均显著低于对照组(图 4，P均 < 0.001)，提示感觉运动门控功能受损；治疗组3种预脉冲强度的PPI%均显著高于模型组(P均 < 0.001)；与对照组相比，治疗组在预脉冲强度为PPI6(P=0.171)和PPI12(P=0.994)时PPI%差异无统计学意义。
图4 UA和MK-801干预对小鼠感觉运动门控的影响

Figure 4 Effects of UA and MK-801 interventions on sensorimotor gating in mice

A, flow chart of prepulse inhibition experiment; B, statistics of shock reflection amplitude inhibition rate; n = 6－10; error bar represents the standard deviation; PPI(%), inhibitory rate of prepulse on the amplitude of startle stimulus; PPI3%, PPI6%, and PPI12% respectively refer to the inhibition rate of shock reflection amplitude when the pre pulse intensity is 73 dB, 76 dB, and 82 dB; ☆ P < 0.01, compared with Sham+vehicle group, # P < 0.01, compared with MK-801+vehicle group. UA, ursolic acid; MK-801, dizocilpine maleate.

2.4 UA治疗缓解SZ小鼠脑内脱髓鞘损伤

用激光扫描共聚焦显微镜观察参与构成ISF分区引流屏障的内囊区，评估致密髓鞘的完整性，低倍镜观察发现模型组内囊区髓鞘致密性受到破坏，治疗组髓鞘致密性较模型组得到恢复，高倍镜下发现模型组中内囊区致密髓鞘结构存在脱髓鞘现象，治疗组内囊区致密髓鞘结构脱髓鞘的情况得到改善(图 5)。
图5 UA和MK-801干预对小鼠髓鞘的影响

Figure 5 Effects of UA and MK-801 intervention on the myelin sheath in mice

A, compact myelin structure between caudate nucleus and thalamus(scale bar=1.5 mm); the dashed area is the ISF drainage barrier; B, changes in the density of myelin sheath in the inner capsule area (scale bar=0.5 mm); C, injury of myelinated fiber bundles(scale bar=50 μm); arrow indicate significant demyelinating pathological changes in the model group. UA, ursolic acid; MK-801, dizocilpine maleate.

2.5 UA干预改善SZ小鼠脑区间局部的ISF返流

为探究脑区间局部ISF引流的改变，用立体定位仪向尾状核区注射荧光示踪剂LY探究ISF引流改变情况，图 6为示踪剂扩散1 h后向头侧皮层及尾侧丘脑扩散的荧光面积比较；对于向头侧皮层引流的ISF正常清除路径，模型组荧光扩散面积显著大于对照组[(13.93±3.35) mm2 vs. (2. 79±0.94) mm2, P < 0.001]；治疗组扩散面积显著低于模型组[(7.93±2.48) mm2 vs. (13.93±3.35) mm2, P < 0.001]。在扩散1 h后对照组示踪剂并不返流到尾侧丘脑区域；相较于对照组，模型组示踪剂则跨过屏障结构返流到尾侧丘脑区域[(2.48±0.38) mm2 vs. (0.05±0.12) mm2, P < 0.001];治疗组相较于模型组示踪剂向尾侧丘脑区扩散的面积显著减小[(0.50±0.30) mm2 vs. (2.48±0.38) mm2, P < 0.001]。
图6 UA和MK-801干预对小鼠ISF引流的影响

Figure 6 Effects of UA and MK-801 intervention on ISF drainage in mice

Fluorescent tracer images (scale bar=1.5 mm). UA, ursolic acid; MK-801, dizocilpine maleate.

2.6 UA治疗改善SZ小鼠脑内AQP4表达和极性

AQP4介导ISF与脑脊液(cerebrospinal fluid, CSF)间的液体交换，有助于ISF中代谢废物向外周的清除[18]。为探究小鼠脑内AQP4表达和极性的变化，造模成功后对脑组织进行冰冻切片，进行免疫荧光组织化学实验(图 7)。在对照组中，AQP4在脑微血管周围分布，在星形胶质细胞足突终末端高度表达，荧光图像上呈规则的中空管状结构；模型组中AQP4的极性分布受到干扰，在荧光图像上分布较弥散，中空管状结构受到影响，极性破坏；治疗组在模型组的基础上AQP4极性分布有所恢复。对各组AQP4荧光面积进行统计分析发现，模型组鼠脑AQP4含量较对照组明显下降[(3 663.88±733.77) μm2 vs. (13 354.92±4 054.05) μm2, P < 0.001]；治疗组AQP4含量较模型组显著升高[(11 104.68±3 200.04) μm2 vs. (3 663.88±733.77) μm2, P < 0.001]，与对照组相比差异无统计学意义[(11 104.68±3 200.04) μm2 vs. (13 354.92±4 054.05) μm2, P=0.264]。
图7 UA和MK-801干预对小鼠脑内AQP4含量的影响

Figure 7 Comparison of AQP4 expression between groups

AQP4 immunofluorescence images (scale bar=250 μm). UA, ursolic acid; MK-801, dizocilpine maleate.

3 讨论

髓鞘在维持脑内微环境稳态及认知形成的过程中发挥着重要功能，SZ小鼠的各项行为学异常可能与MK801诱导的脱髓鞘的病理改变有关[6, 8]。本研究髓鞘反射光检测结果显示MK801诱导的SZ小鼠内囊区出现了显著的脱髓鞘的病理改变；弥散张量成像的队列研究也表明，SZ患者的内囊区是易感白质纤维束，其微观结构受损与SZ症状的严重程度密切相关[19-20]。
SZ模型鼠内囊区域的脱髓鞘病理改变还继发了ISF的引流紊乱，这与Wang等[6]报道的药物诱导脱髓鞘继发的ISF引流紊乱相一致。相关研究表明，内囊区髓鞘的完整性可以保障ISF分区引流，避免尾状核与丘脑两个毗邻脑区之间ISF的相互沟通，维持了两个脑区神经功能上的独立性[6, 8]。SZ模型鼠内囊脱髓鞘继发的ISF分区引流紊乱，加重了认知等的功能损害，可能与扰乱局部微环境稳态有关[20]。近年来，ISF的功能被逐步揭示，ISF的正常引流有助于脑内代谢废物的清除，还决定着局部神经递质作用的范围和程度，对维持脑内微环境稳态具有重要意义[21-22]。有研究表明，尾状核参与多种高级神经功能，包括运动、执行、情绪、学习和记忆等功能[23]；而本研究发现的尾状核ISF引流紊乱，可能通过扰乱尾状核局部微环境稳态，进而加重SZ运动亢进、刻板行为、焦虑抑郁、认知障碍等症状[24]。
事实上，SZ的ISF分区引流破坏不仅扰乱尾状核区域的微环境，同时导致了额叶皮层的受累。SZ模型鼠脱髓鞘病理改变继发了尾状核区ISF向头侧皮层区的异常引流和聚集，这一现象可能与SZ模型鼠皮层AQP4含量下降且极性遭到破坏有关。有研究表明，脑深部脑区(如尾状核)ISF的最典型引流途径就是沿着白质纤维束流动到浅表皮层区域，并通过水通道蛋白(如AQP4)最终汇聚到蛛网膜下腔[18, 25]。这一经典引流路径对于脑深部实质内ISF中的代谢废物通过CSF到达外周清除是至关重要的[18]。而AQP4等水通道蛋白的异常会导致这一典型引流路径出现中断，并导致清除功能异常，同时导致富含代谢废物的ISF在皮层区域内聚集，并进一步加重ISF引流通道的阻塞[26]。大脑皮层主要负责感觉和认知等高级功能，同时与人的意识活动高度相关。已经有研究表明，皮质区域ISF流量的下降会导致炎症因子和神经毒性元素的积聚(如干扰素-γ、肿瘤坏死因子和淋巴毒素α/β等)，从而引发炎症及皮质脱髓鞘，造成皮层认知功能的异常[27]。
除了皮层区的ISF引流受累外，SZ模型鼠内囊区脱髓鞘还继发了尾状核内的ISF向尾侧返流到达丘脑区，干扰丘脑区正常的ISF引流；局部ISF的返流使两个相互独立脑区间出现了ISF的沟通，并可能导致神经递质从尾状核高浓度区向丘脑低浓度区的转移[28]；神经递质的异常分布可能引起丘脑区场电位的异常，进而破坏了丘脑的中继功能[29]。丘脑作为重要的中继核团，为多条神经回路提供节点链接，如海马-额叶皮层、纹状体-额叶皮层等，介导运动、认知等多种脑功能[29-30]。尾状核局部ISF返流到丘脑对于丘脑微环境稳态以及丘脑中继功能的破坏可能导致SZ认知异常等症状的加重[30]，这与临床SZ患者丘脑损伤相一致，提示SZ患者丘脑功能受损可能与毗邻脑区ISF内神经递质的异常返流作用于丘脑有关[28]。
本研究还表明，UA可以缓解分区屏障的髓鞘损伤，这与UA改善多发性脱髓鞘的研究报道相一致[11, 31]，其机制可能与直接促进少突胶质细胞的成熟进而加快中枢神经系统的髓鞘再生修复有关[12, 31]；也有可能与UA的广谱抗炎机制有关[12]，但是UA对于SZ模型鼠的髓鞘保护的分子机制尚待进一步研究。不过可以肯定的是，UA对于SZ的这种髓鞘保护可以逆转ISF引流的紊乱。本研究中，治疗组小鼠丘脑和尾状核的ISF独立引流特性相较SZ小鼠显著改善，提示UA成功逆转了SZ的分区引流紊乱。UA缓解SZ的ISF引流紊乱，可能有助于脑内微环境稳态得以重新建立，从而使脑区间依赖递质传递的神经传导通路功能得到修复[28]。此外，UA除了修复髓鞘改善ISF引流之外，还可能通过恢复AQP4表达和极性来改善代谢废物在额叶皮层的堆积。最终，UA治疗通过缓解ISF分区引流紊乱，挽救了尾状核、丘脑及皮层区的微环境紊乱和功能受损，进而成功改善了SZ模型小鼠的焦虑迟钝、自发活动增加、注意力集中异常等症状。上述研究结果提示UA是一种潜在的以髓鞘为靶点的改善ISF引流紊乱的SZ治疗药物[10-11]。
本研究存在一定局限性，内囊作为广泛的皮层和皮层下连接的白质纤维束，其完整性受损也影响了相关脑区的介观联系，这种内囊脱髓鞘继发的ISF引流紊乱及神经环路的改变对于疾病发生发展的贡献度还需进一步明确。此外，有学者发现SZ患者脑内的白质区域存在广泛的微观结构破坏[4-5]，本研究主要关注了SZ小鼠内囊区致密髓鞘结构的病理改变，尚未关注SZ小鼠其它脑区间的广泛白质富集区。同时，UA对髓鞘的治疗和保护作用也并非是内囊特异性的，既往研究已经发现UA对存在于脑内及脊髓区的髓鞘结构表现出了广泛的再生和保护作用[31]。今后，本课题组将进一步探究UA对SZ小鼠脑内其余各脑区间髓鞘及间质液引流紊乱的治疗和保护作用，基于SZ小鼠脱髓鞘的分子机制进一步优化UA药物和给药方式。
综上所述，本实验从脑内微环境稳态的角度探究SZ的发病机制，提出脱髓鞘继发的ISF分区引流紊乱是SZ潜在的发病机制，递质传递依赖于脑内微环境的稳态，脱髓鞘继发的跨脑区联系ISF分区引流紊乱将导致脑区间神经递质沟通出现异常，原本被致密髓鞘结构限制在各自脑区的递质在脑区间相互交通，可能是导致SZ脑区间多巴胺能系统及谷氨酸能系统功能紊乱的潜在病理机制，从而继发SZ的思维障碍、运动亢进、焦虑，以及认知功能损害等临床症状[9, 32-33]。天然小分子药物UA的治疗能通过促进髓鞘修复的方式改善脑区间ISF引流紊乱，还能帮助SZ小鼠脑内AQP4表达的恢复，促进ISF内代谢废物向CSF的清除。本研究为针对SZ患者髓鞘和ISF引流的预防性治疗奠定了基础，提供了一种SZ治疗的新视角。

利益冲突  所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明  龙仁：提出研究思路；龙仁、毛鑫：设计研究方案，撰写论文；龙仁、高天资、解倩、谈瀚博、李子寅：收集、分析、整理数据；韩鸿宾、袁兰：提出研究思路，总体把关和审定论文。

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