口腔鳞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)约占口腔恶性肿瘤的90%以上，全球每年新发病例超过37万例，死亡约18.8万例[1]。我国每年新发病例约6.5万例，死亡约3.5万例[2]，与2015年相比，新发及死亡人数均呈明显上升趋势[3]。尽管口腔鳞癌的治疗方法不断更新，但5年生存率长期停滞于50%~60%[4]，肿瘤异质性及治疗耐药性依然是精准诊疗面临的核心瓶颈。传统研究模型(如细胞系)存在遗传突变、患者来源异质性不足、缺乏肿瘤微环境等局限，患者来源异种移植(patient-derived xenografts，PDX)虽能保留部分肿瘤特征，但培养周期长、成本高，难以满足快速临床决策的需求。
患者来源肿瘤类器官(patient-derived tumor organoids, PDOs)技术通过三维培养实现肿瘤组织在体外的自组装，高度保留了原发肿瘤的关键生物学特征，包括组织学结构、细胞异质性和分子遗传特性。这一突破性技术为肿瘤个体化治疗研究提供了全新的实验平台，显著提升了临床前研究的预测价值[5-7]。2018年Tanaka等[8]首次报道头颈部鳞癌类器官构建技术，但OSCC因起源于外胚层、基质成分复杂，其类器官构建面临培养成功率低、免疫组分缺失、冻存后复苏困难等技术瓶颈。北京大学口腔医院蔡志刚团队在国家重点研发计划(2022YFC2504200)及国家自然科学基金(82373434和82002878)等项目支持下，通过优化培养基组分、精准调控酶消化条件及阶梯式冻存策略，将OSCC类器官建库成功率提升至95%以上，并率先实现同一患者的癌组织、淋巴结转移灶及正常黏膜的同步培养(专利号：ZL202311378598.3)，同时建立了配套的药物敏感性检测平台[9]，为解析OSCC耐药、转移机制及指导个体化治疗提供了独特平台。
本文将系统阐述OSCC类器官库的构建策略，包括关键技术创新和质量控制体系，并探讨其在药物筛选、精准分型及个体化治疗指导中的转化应用价值，结合团队研究成果，展望OSCC类器官技术在推动口腔精准医疗发展中的潜力与前景。
1 口腔鳞癌类器官库构建的标准化流程与技术创新
随后，在国家重点研发计划的支持下，本课题组持续优化OSCC类器官模型构建的条件，包括样本采集和预处理、原代培养、传代、冻存和复苏、鉴定，逐渐形成了覆盖全流程的OSCC类器官模型标准化构建流程。依据该流程和实验技术指南，OSCC类器官的建模成功率突破95%，达到了国内外领先水平，获批了发明专利[14]，并依托中华口腔医学会立项了技术指南(指南名称：人源口腔鳞癌类器官库构建的技术指南；指南编号：2024-08)，相关指南正在撰写中，下面简要介绍本课题组建立的OSCC类器官库标准化构建流程。
1.1 组织样本的获取与运输
类器官培养所用组织应取自经病理确诊的OSCC患者病变部位，避开坏死区及非肿瘤区，优选肿瘤干细胞富集区域。每份组织大小以黄豆粒为宜。取材后用生理盐水冲洗3次，转入4 ℃组织保存液保存，并在低温条件下尽快运输至实验室，于离体48 h内完成处理。
1.2 类器官的原代培养
处理标本时，先去除坏死组织及正常脂肪、肌肉组织，并用含抗生素的磷酸盐缓冲液冲洗。随后将组织剪碎，于37 ℃条件下消化45~75 min，并通过摇床振荡促进组织解离。消化液经过滤、离心去除上清，必要时进行红细胞裂解。计数后将细胞与基质胶混匀，接种于24孔板中央(约30 μL/孔)。待基质胶凝固后加入完全培养基，于37 ℃培养，每2~3天更换培养基并拍照记录生长状态。
1.3 类器官的传代培养
类器官直径达到100~200 μm时可进行传代。将类器官从培养板刮下，在冰上将基质胶软化并吹打分散，随后消化10 min，再终止反应。离心重悬后，将所得细胞分为两部分：一部分用于继续培养，另一部分用于冻存，以保留各代类器官的原始信息。
1.4 类器官的冻存与复苏
冻存前，将类器官混匀于无血清冻存液。每个冻存管中分装约500 μL冻存液，经程序降温后-80 ℃过夜，再转入液氮长期保存。复苏时，从液氮中取出冻存管快速复温，缓慢稀释并离心去除上清液，计数后与基质胶混匀接种，待基质胶凝固后加入完全培养基，于37 ℃、5%(体积分数) CO2条件下培养，隔日换液，并观察状态。
1.5 类器官的质量检测与鉴定
形态学方面，可采用苏木精-伊红(hematoxylin and eosin，HE)染色比较类器官与原肿瘤的细胞及组织结构。分子水平上，推荐使用免疫组织化学或免疫荧光检测p40、p63、CK5/6等口腔鳞癌相关标志物的表达。遗传学检测可通过基因测序分析类器官与原肿瘤的突变谱，评估模型的代表性与稳定性。
2 口腔鳞癌类器官库的转化应用
肿瘤类器官是连接基础研究与临床转化的桥梁，能够整合肿瘤研究的全流程链条：从机制探索到药物开发，再到临床诊疗应用。这一技术在耐药机制解析、新靶点发现及个性化治疗中具有独特优势，有望推动精准医疗的实施。
2.1 药物筛选与疗效评估
OSCC的低应答率及耐药性是晚期肿瘤治疗的难点。类器官模型在药物筛选与疗效评估上具有较大潜力。就药物筛选而言，OSCC类器官模型能保留肿瘤细胞异质性与生物学特性，更逼真地模拟体内肿瘤生长环境。2018年，Tanaka等[8]首次证实，不同患者来源的头颈部肿瘤类器官(包含27例口腔癌)对化疗的反应不同，且这些反应与患者的临床反应相对应，提示肿瘤类器官模型是药物筛选的良好预测模型。随后Driehuis等[10]和Millen等[15]证实，头颈肿瘤类器官不仅可以用作某一药物的敏感性预测，还可以用于探索联合治疗方案，同时发现类器官体外放疗敏感性与临床复发率一致，这一结果提示，肿瘤类器官模型可以指导放化疗及靶向治疗，为OSCC精准医疗提供新范式。针对类器官的药物筛选，本课题组将不同类型并设置剂量梯度的抗癌药物作用于口腔鳞癌类器官模型，基于三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)发光法评估细胞活性，绘制剂量-反应曲线并计算半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration, IC50)，同时观察生长、增殖与凋亡等表型变化，用以筛选对OSCC更为敏感的药物，结果显示，不同患者来源的类器官对药物的应答差异有统计学意义，提示该平台能够较好反映肿瘤异质性，具备高效、可重复的体外药敏评估能力，可为晚期OSCC个体化治疗方案的制定提供实验支持[13]。此平台亦进一步对已构建类器官开展多组学分析，系统解析药物作用靶点及关键信号通路，并在体外模拟患者治疗过程，精准预测个体患者对不同治疗方案的敏感性差异，从而为临床制定个性化治疗方案提供重要实验依据。
本课题组在药物筛选平台建立的基础上，首次提出针对OSCC的“抗唾液酸化癌源性免疫球蛋白(sialylated cancer IgG，SIA-cIgG)化疗联合方案”。SIA-cIgG是一种独特的仅由肿瘤细胞产生的IgG分子，参与多种上皮来源恶性肿瘤的恶性生物学行为，并具有良好的靶标性[16-17]。本课题组通过已建立的OSCC类器官平台对4种OSCC常用化疗药物顺铂、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)、多西他赛(docetaxel，DTX)和紫杉醇(paclitaxel，PTX)进行检测，发现SIA-cIgG表达水平与顺铂的IC50呈正相关，提示SIA-cIgG导致原发性顺铂耐药；经4种化疗药物处理后，类器官的SIA-cIgG表达水平进一步升高，下游关键存活通路SRC/AKT激活，提示SIA-cIgG参与继发性化疗耐药。而通过在25例OSCC类器官中横向比较抗SIA-cIgG化疗联合方案与现有OSCC化疗联合方案的治疗效果发现，抗SIA-cIgG化疗联合方案不仅表现出最佳的类器官杀伤能力，还能够克服不同OSCC类器官之间的药物反应差异；机制研究显示，SIA-cIgG通过抑制下游抑癌因子酪氨酸磷酸酶非受体13(protein tyrosine phosphatase non-receptor 13，PTPN13)参与肿瘤干性调控和化疗耐药，抗SIA-cIgG通过提高PTPN13转录水平和蛋白稳定性发挥干性抑制和克服化疗耐药的功能。此研究系统阐述了SIA-cIgG的耐药机制，并验证了抗SIA-cIgG化疗联合方案的治疗效果，体现了本课题组基于OSCC药筛平台进行基础研究-临床转化的研究理念[18]，相关内容待正式发表。
然而，当前OSCC类器官模型在药物筛选与疗效评估中仍面临一些挑战。最突出的问题在于类器官模型和体内肿瘤微环境存在差异，主要体现在免疫细胞缺失、血管网络不足及细胞外基质成分改变等方面，这些因素可能影响药物筛选和疗效评估准确性。为突破这一瓶颈，本课题组未来将着重加强对多维度类器官模型的开发，提升其对体内肿瘤生物学行为的模拟能力，并开展OSCC与肿瘤微环境相互作用研究，使类器官模型更好模拟体内肿瘤真实情况，最终推动OSCC治疗领域的突破性进展。
2.2 肿瘤发生机制研究
OSCC的肿瘤形成机制复杂，涉及多阶段、多因素的调控网络。OSCC类器官模型能够高度重现从正常上皮到癌变的动态演进过程：生理状态下，口腔上皮细胞处于稳定更新与分化平衡态；而当长期暴露于烟草、乙醇或人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)感染等致癌因素时，细胞内关键信号通路的异常激活或失活将逐步破坏这一平衡。通过构建OSCC类器官模型，可以直观看到：(1)始发基因突变(如关键抑癌基因p53)如何引起细胞周期调控失衡，进而引起异常增殖与分化；(2)遗传变异的累积如何导致关键信号通路(如NOTCH通路)的过度激活；(3)单个突变细胞如何逐步发展成有一定规模的异常细胞群体，这对深入理解肿瘤起始的时空变化提供了观察窗口。此外，肿瘤微环境在肿瘤发生发展中非常关键，OSCC类器官模型可模拟肿瘤微环境构成及其相互作用。肿瘤微环境包含多种细胞成分，如成纤维细胞、免疫细胞等以及细胞外基质，类器官模型为研究不同成分间信号交流与相互作用提供了帮助。成纤维细胞能分泌多种生长因子与细胞外基质成分来促使肿瘤细胞存活与增殖[19-20]。Zhao等[21]在类器官模型中验证了Wnt通路活性在促进OSCC干细胞样功能上的作用，并证明单羧酸转运蛋白1(monocarboxylate transporter 1, MCT1)可能是一个有潜力的治疗靶标。
2.3 肿瘤转移诱因探索
在泛转移头颈鳞癌的精准组学图谱引导下，本团队通过基因编辑手段调控PDOs中WD重复结构蛋白54(WD repeat domain 54, WDR54)的表达水平，部分重现了由TGFβ-TGFBR-Smad2/3/4信号轴驱动的细胞身份重塑过程，该过程发生于肿瘤转移早期，由上皮-间充质可塑性(epithelial-mesenchymal plasticity, EMP)主导，并伴随细胞迁移性的增强。在过表达WDR54-PDOs模型中，尽管上皮钙黏蛋白表达得以维持，其亚细胞定位的错位、细胞极性的丧失及泛素化修饰的启动，均悄然揭示了部分上皮-间充质转化(partial epithelial-mesenchymal transition, pEMT)状态的萌芽。事实上，相较于传统上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，混合状态在癌转移中的功能意义更为深远。具体而言，过表达WDR54类器官的迁移方式由“肿瘤芽”转变为“弥散式播散”，伴随先导细胞数量的显著增加。这一转变不仅与临床中观察到的浸润模式分级(worst pattern of invasion, WPOI)等级升高、基质硬化及广泛转移形成相互印证，也提示WDR54在空间动态调控中的关键角色。
进一步地，针对PDOs的靶点切割与转座标记(cleavage under targets and tagmentation, CUT&Tag)测序揭示：在原生表观遗传背景下，WDR54靶向组蛋白H3赖氨酸4三甲基化(histone H3 lysine 4 trimethylation, H3K4me3)与组蛋白H4赖氨酸16乙酰化(histone H4 lysine 16 acetylation, H4K16ac)位点的修饰，或构成细胞身份转化的起始信号。有趣的是，与伪时间轨迹分析相一致，表观基因组图谱在转化初期显现出极为幼稚的胚胎发育程序，暗示胎源转录程序驱动的去分化过程或为pEMT的首波浪潮，从而赋予细胞重塑更高的可塑性与迁移潜能。此外，本课题组基于WDR54基因编辑的头颈鳞癌PDOs进一步构建了原位异种移植模型，观测到其可诱导颈部淋巴结的转移扩散，为其体内功能提供了实证支持。展望未来，值得重点推进的研究方向包括基于类器官平台解析WDR54的蛋白互作网络，深入剖析其所介导的转分化信号级联路径；在技术策略上，可探索多靶点单一分子的开发，诸如靶向WDR蛋白家族中非遗传性染色质修饰亚群的蛋白质降解靶向嵌合体(proteolysis-targeting chimera, PROTAC)分子，其设计可基于家族所共享的保守七叶β螺旋结构域，开辟靶向转移与可塑性调控的新路径。此外，肿瘤类器官模型在宿主-微生物研究、肿瘤异质性与进化研究、基因编辑与功能基因组学、生物标志物开发等领域也起着重要的工具和桥梁作用。
3 面临的挑战与未来研究方向
尽管口腔鳞癌类器官技术在基础研究与临床转化中展现出广阔前景，但在模型构建与应用中仍面临多方面挑战。
3.1 免疫微环境缺失
3.2 血管化不足
当类器官直径超过500 μm时，其中心常出现坏死，影响药物渗透和评估的准确性。目前，本课题组正在进行血管内皮细胞共培养及3D生物打印血管网络相关研究，以实现类器官的功能性血管化，改善营养与药物在模型中的分布。
3.3 未来研究方向
未来可基于多组学信息构建“数字化孪生”模型，通过类器官药物敏感性检测，结合基因组/转录组/蛋白组，实现人工智能算法，预测最佳治疗方案，并在前瞻性临床试验中加以验证，实现类器官指导口腔鳞癌个体化精准治疗。
综上所述，口腔鳞癌类器官库的构建标志着口腔鳞癌研究进入“患者镜像”时代。北京大学口腔医院蔡志刚课题组通过技术创新和临床转化探索，建立了高效稳定的OSCC类器官库平台，建库成功率突破95%，并率先实现多组织同步建库。该平台不仅为基础研究解析肿瘤异质性及耐药机制提供了不可替代的工具，更在个体化药物筛选、放疗增敏策略优化及免疫治疗预测中展现出潜在的临床价值，有望实现“在培养皿中预测治疗反应”的精准医疗愿景。未来，融合类器官功能数据与真实世界临床信息的“数字化患者”模型，将为口腔鳞癌的个体化诊疗提供终极解决方案。
