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北京大学学报（医学版） >

2025 , Vol. 57 >Issue 5: 875 - 883

DOI: https://doi.org/10.19723/j.issn.1671-167X.2025.05.011

论著

水通道蛋白5对干燥综合征大鼠TLR4/MyD88/NF-κB信号的影响

  • 朱丽秀 1 ,
  • 陈仁利 , 1, * ,
  • 周素娟 2 ,
  • 林烨 1 ,
  • 汤一榕 1 ,
  • 叶桢 1
展开
  • 1. 宁德师范学院附属宁德市医院/福建医科大学附属宁德市医院风湿免疫科, 福建宁德 352100
  • 2. 宁德师范学院附属宁德市医院/福建医科大学附属宁德市医院病理科, 福建宁德 352100

收稿日期: 2023-05-05

  网络出版日期: 2025-07-25

基金资助

宁德市自然科学基金联合项目(2022J09)

宁德师范学院2023年上半年校级科研项目(2023ZX702)

版权

版权所有，未经授权，不得转载。
收起

Effect of aquaporin 5 on TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway in Sjögren syndrome rats

  • Lixiu ZHU 1 ,
  • Renli CHEN , 1, * ,
  • Sujuan ZHOU 2 ,
  • Ye LIN 1 ,
  • Yirong TANG 1 ,
  • Zhen YE 1
Expand
  • 1. Department of Rheumatology and Immunology, Ningde Hospital Affiliated to Ningde Normal University/Ningde Hospital Affiliated to Fujian Medical University, Ningde 352100, Fujian, China
  • 2. Department of Pathology, Ningde Hospital Affiliated to Ningde Normal University/Ningde Hospital Affiliated to Fujian Medical University, Ningde 352100, Fujian, China
CHEN Renli, e-mail,

Received date: 2023-05-05

  Online published: 2025-07-25

Supported by

the Natural Science Foundation of Ningde(2022J09)

the Ningde Normal University Joint University-Level Scientific Research Projects in the First Half of 2023(2023ZX702)

Copyright

All rights reserved. Unauthorized reproduction is prohibited.
Fold

摘要

目的: 探讨水通道蛋白5(aquaporin 5, AQP5)对干燥综合征(Sjögren syndrome, SS)大鼠Toll样受体4(Toll-like receptor 4, TLR4)/髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88, MyD88)/核因子κB(nuclear factor κB, NF-κB)信号的影响。方法: 从基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus, GEO)中提取SS基因表达数据集GSE406611和GSE84844, 使用R软件分析AQP5的mRNA表达。构建大鼠SS模型, 将造模成功的大鼠随机分为SS组、SS+NC组和SS+pc组, 每组各10只; 取10只正常大鼠作为Normal组。SS+NC组大鼠于颌下腺位置每日一次皮下注射10 μg的rno-pcDNA3.1-AQP5-NC, SS+pc组大鼠于颌下腺位置每日一次皮下注射10 μg的rno-pcDNA3.1-AQP5, 连续注射28 d。采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒检测大鼠血清中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和白细胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)的含量, 采用高通量测序确定靶点基因, 采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qPCR)和Western blot检测大鼠颌下腺组织中AQP5、TLR4、MyD88、NF-κB的mRNA水平和蛋白表达情况。结果: 在SS数据集GSE406611和GSE84844中, AQP5的mRNA表达明显降低。与Normal组相比, SS组大鼠血清中TNF-α和IL-1β的含量明显升高, TLR4、MyD88、NF-κB的mRNA和蛋白表达明显升高, AQP5的mRNA和蛋白表达明显降低; 过表达AQP5后, SS+pc组大鼠血清中TNF-α和IL-1β的含量明显降低, TLR4、MyD88、NF-κB的mRNA和蛋白表达明显降低, AQP5的mRNA和蛋白表达明显升高, 差异均有统计学意义(均P < 0.05)。结论: AQP5参与SS的进展, AQP5的表达升高能明显抑制炎症性应激, 减轻颌下腺组织病理损伤, 这可能与抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号的传导有关。

关键词： 水通道蛋白质5; 干燥综合征; Toll样受体4; 髓样分化因子88; NF-κB; 信号通路

本文引用格式

朱丽秀 , 陈仁利 , 周素娟 , 林烨 , 汤一榕 , 叶桢 . 水通道蛋白5对干燥综合征大鼠TLR4/MyD88/NF-κB信号的影响[J]. 北京大学学报（医学版）, 2025 , 57(5) : 875 -883 . DOI: 10.19723/j.issn.1671-167X.2025.05.011

Abstract

Objective: To investigate the effect of aquaporin 5 (AQP5) on Toll-like receptor 4 (TLR4)/myeloid differentiation factor 88 (MyD88)/nuclear factor κB (NF-κB) signaling pathway in Sjögren syndrome (SS) rats. Methods: The SS gene expression data sets GSE406611 and GSE84844 were extracted from the Gene Expression Omnibus (GEO), and the AQP5 mRNA expression was analyzed by R software. The rat SS model was constructed. The successfully modeled rats were divided into SS group, SS+NC group, and SS+pc group, 10 rats in each group; and 10 rats were set as Normal group. The rats in the SS+NC group were injected with 10 μg of rno-pcDNA3.1-AQP5-NC at the submandibular gland, subcutaneously every day for 28 days. The rats in the SS+pc group were injected with 10 μg of rno-pcDNA3.1-AQP5 at the submandibular gland, subcutaneously every day for 28 days. The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit was used to detect the content of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-1β (IL-1β) in the serum. High-throughput sequencing was used to identify the target genes. Quantitative real-time PCR (qPCR) and Western blot were used to detect the mRNA and protein expressions of AQP5, TLR4, MyD88, and NF-κB in the rat submandibular gland tissue. Results: In the SS dataset GSE406611 and GSE84844, the mRNA expression of AQP5 in SS was significantly reduced. Compared with the Normal group, the content of TNF-α and IL-1β in the serum, the mRNA and protein expressions of TLR4, MyD88, and NF-κB in the SS group were significantly increased, the mRNA and protein expressions of AQP5 were significantly decreased. After overexpression of AQP5, the content of TNF-α and IL-1β in the serum, the mRNA and protein expressions of TLR4, MyD88, and NF-κB in the SS+pc group were significantly decreased, the mRNA and protein expressions of AQP5 were significantly increased. The differences were statistically significant (all P < 0.05). Conclusion: The expression of AQP5 is involved in the progression of SS. Increasing the expression of AQP5 can significantly inhibit inflammatory stress and reduce the pathological damage of submandibular gland tissue. This may be related to the inhibition of TLR4/MyD88/NF-κB conduction.

Key words： Aquaporin 5; Sjögren syndrome; Toll-like receptor 4; Myeloid differentiation factor 88; NF-kappa B; Signaling pathway

干燥综合征(Sjögren syndrome，SS)是一种临床上常见的发病机制尚未阐明的慢性系统性的免疫性疾病，该病好发于中老年女性，主要以口干、眼干为主要临床症状，存在泪腺以及唾液腺受累严重的现象，若不能及时、有效地控制疾病进展，极易诱发肝、肺、肾、血管等全身性组织和器官受累，增加患者出现淋巴瘤等恶性疾病的风险[1]。SS发病早期的症状较轻，患者对疾病的认知度不高，且临床上缺乏特异性的监测指标，患者确诊时往往已出现多组织和器官的系统性损害[2]。因此，寻找SS发生、发展的特异性分子生化标志物具有重大临床意义。水通道蛋白5(aquaporin 5，AQP5)是AQP家族中的重要成员之一，是一种细胞膜上的特异性跨膜转运蛋白，其基因的表达能调控细胞膜的通透性，调节细胞内外水的平衡[3]。Chivasso等[4]的研究显示，在SS患者的小唾液腺泡中，AQP5的表达明显降低，腺泡水调节功能异常，导致患者的唾液腺功能进行性减退。目前尚未见AQP5在SS中作用机制的报道，既往的研究多集中在免疫调控以及淋巴细胞浸润等方面，Soyfoo等[5]的研究指出，炎症性应激始终伴随着SS的发病以及病情进展，并随着血液循环将肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)等炎性介质在血管微循环中进行交换，将SS的病灶转移至其他靶器官中。Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)/髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)/核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)信号是一条内源性的，与免疫调节、炎症性应激以及细胞代谢等多种病理过程密切相关的通路[6]。梅寒颖等[7]的研究显示，在SS小鼠模型中，抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号的传导，能明显改善实验小鼠的临床症状，减轻其颌下腺的病理损伤。本研究通过构建SS大鼠模型，探讨AQP5在SS中的表达以及其对TLR4/MyD88/NF-κB信号的调控作用，希望为SS的临床治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 在线生物信息的提取

从基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus，GEO)中提取SS基因表达数据集GSE406611(包括17例SS患者和18例健康对照)和GSE84844(包括30例SS患者和30例健康对照)，并通过R 4.3.1软件分析SS患者和对照者差异表达的基因，同时对AQP5的mRNA表达进行统计分析，并将AQP5的mRNA表达与相关基因的表达进行Spearman分析。

1.2 实验动物、试剂与仪器

选择无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级、周龄10~12周的SD雌性大鼠43只，体重(300±20) g，购自上海昇敞生物科技有限公司，动物的生产许可证号：SCXK(沪)2021-0002。于SPF级动物房中，温度(23±2) ℃、湿度55%±5%、12 h/12 h明暗交替的条件下进行适应性喂养。本研究通过宁德市医院动物伦理委员会审核批准(2022-0071564-FV03)，在实验过程中遵循3R原则，给与动物人道主义关怀。
实验使用的主要试剂有胰酶消化液、磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)、兔抗大鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehydes3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗体(美国Invitrogen公司)、苏木素-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)、Western blot试剂盒(南京建成生物科技有限公司)、Trizol reagent试剂盒、逆转录试剂盒(武汉普诺赛生命科技有限公司)。升高AQP5表达的rno- pcDNA3.1-AQP5以及其阴性对照rno-pcDNA3.1-AQP5-NC由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。
实验使用的主要仪器有垂直电泳仪(北京六一仪器厂)、3K-15高速离心机(德国Eppendorf公司)、全自动凝胶成像系统、CFX96实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)仪(美国Bio-Rad公司)、光学显微镜(日本Olympus公司)等。

1.3 SS大鼠模型的制备

根据宋维海等[8]报道的方法，将3只大鼠麻醉后，在无菌操作台上，显微镜下解剖取出大鼠颌下腺，剔掉结缔组织，以无菌水清洗干净，剪碎，匀浆，超声破碎，离心，取上清液，调整上清液浓度至100 mg/g，以体积比为1 ∶ 1的比例加入弗氏完全佐剂(Freund complete adjuvant, FCA)，轻微摇晃2~3 min，超声乳化后作为抗原乳化剂，将0.15 mL的抗原乳化剂皮下注射进大鼠的足垫、腹股沟以及后背等位置。当大鼠出现口腔内唾液量明显减少，饮水量明显增加，HE染色显示颌下腺出现明显的病理损伤时，视为造模成功，本实验共造模成功30只大鼠。

1.4 实验的分组和处理

将rno-pcDNA3.1-AQP5-NC和rno-pcDNA3.1-AQP5均以无菌水(体积比1 ∶ 20)进行稀释。
将造模成功的大鼠随机分为SS组、SS+NC组、SS+pc组，每组10只；另取10只正常大鼠作为Normal组(造模时在相同部位注射等剂量的生理盐水)。于SS+NC组大鼠颌下腺位置每日一次皮下注射10 μg的rno-pcDNA3.1-AQP5-N C，于SS+pc组大鼠颌下腺位置每日一次皮下注射10 μg的rno-pcDNA3.1-AQP5，连续注射28 d。

1.5 各组大鼠唾液分泌量的检测

实验期间观察各组大鼠饮水与摄食情况，在末次注射完成24 h后，麻醉大鼠，腹腔注射15 mg/kg的毛果芸香碱刺激其唾液分泌，从注射毛果芸香碱结束90 s开始，收集大鼠在7 min内的唾液分泌量；同时留取股静脉血5 mL，离心后获取血清样本待检测。实验结束后处死大鼠，无菌剥离各组大鼠的颌下腺组织。

1.6 各组大鼠颌下腺组织病理活检

取各组大鼠的颌下腺组织，以多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋，冷冻切片机切成4 μm厚的切片，以无菌水充分清洗，经梯度乙醇脱蜡后HE染色，室温避光孵育30 min，PBS清洗，中性树脂封片，光学显微镜下观察。

1.7 大鼠血清中TNF-α和IL-1β含量的检测

取各组大鼠的血清样本，按酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒的要求，检测大鼠血清中TNF-α和IL-1β的含量。

1.8 大鼠颌下腺组织中差异基因的高通量测序

取各组大鼠的颌下腺组织，将正常组与SS组大鼠的颌下腺组织，以及SS+NC组与SS+pc组大鼠的颌下腺组织分别进行高通量测序：按Trizol reagent试剂盒要求提取待测大鼠颌下腺组织中的总RNA，逆转录合成cDNA，经CFX96 qPCR仪扩增后，HiseqTM仪测序，差异表达的基因通过String Tie软件进行筛选，筛选原则是当log2(fold change) >1、P < 0.05、q < 0.05时为差异表达的基因[9]。

1.9 大鼠颌下腺组织中AQP5、TLR4、MyD88、NF-κB的mRNA表达

取各组大鼠的颌下腺组织，按Trizol reagent试剂盒要求提取待测大鼠颌下腺组织中的总RNA，其完整性和浓度经Q1AGEN RNeasy Mini试剂盒确定后，在逆转录试剂盒操作说明书的指导下合成cDNA，使用CFX96 qPCR仪进行扩增[10]。以GAPDH为参照物，目的基因的相对表达以2-ΔΔCt表示。各基因的引物序列见表 1。
表1 各基因的引物序列

Table 1 Primer sequence of each gene

Gene Sequence
rno-AQP5 Forward GGACCTGACCTGCCGTCTAG
Reverse TAGCCCAGGATGCCCTTGAG
rno-TLR4 Forward CCATGAGGCACATTGTTACG
Reverse AAGTGCTTCACCACCTGCTT
rno-MyD88 Forward CTAGCGACAAGCCATACACG
Reverse GTAGCCGAATCGTAGCCAGA
rno-NF-κB Forward GTGGGTTCAGATGAGGAGGA
Reverse TCTGGTCCAAATAGGCTTGG
rno-GAPDH Forward TGTAATAATTGTAGCCAAGTAAATCTCC
Reverse AAGTAACCATTTTTCAAAACATTCAAG

rno, Rattus norvegicus; AQP5, aquaporin 5; TLR4, Toll-like receptor 4; MyD88, myeloid differentiation factor 88; NF-κB, nuclear factor κB; GAPDH, glyceraldehydes3-phosphate dehydrogenase.

1.10 Western blot检测大鼠颌下腺组织中AQP5、TLR4、MyD88、NF-κB的蛋白表达

取大鼠的颌下腺组织，添加适量的组织裂解液，提取样本中的总蛋白，采用二喹啉甲酸试剂盒测定蛋白质含量后，取50 μg进行十二烷基苯磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转膜，室温下以脱脂奶粉进行封闭，加入一抗(AQP5、TLR4、MyD88、NF-κB的稀释比均为1 ∶ 200)，低温孵育过夜，次日加入二抗避光孵育30 min，化学发光后，显影、扫描，以GAPDH作为参照分析各条带的灰度值。

1.11 统计学分析

实验中获得的数据采用SPSS 21.0软件进行统计分析，采用Graphpad 8.1软件作图，各组大鼠血清中TNF-α和IL-1β的含量等符合正态分布的数据，以Shapiro-Wilk检验其正态分布性，采用$\bar x \pm s$表示，正态分布的数据采用Brown-Forsythe检验其组间是否具有方差齐性，两组实验数据的比较，方差齐性通过Mann-Whitney U检验；多组间数据的比较，方差齐性采用单因素方差分析Bonferroni方法检验；方差不齐的采用Kruskal-Wallis H检验，两两组间比较采用Nemenyi检验；P < 0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AQP5在SS患者中的表达

对GSE406611的统计分析显示，与正常对照相比，SS患者中有1 342个基因的表达升高，558个基因的表达降低，其中AQP5的表达明显降低(图 1A)；对GSE84844的统计分析显示，与正常对照相比，SS患者中有1 967个基因的表达升高，1 082个基因的表达降低，其中AQP5的表达明显降低(图 1B)。
图1 在线分析AQP5基因在SS患者中的表达

Figure 1 Online analysis of the expression of AQP5 gene in SS patients

A, the volcanic diagram of differentially expressed genes and expression of AQP5 gene in dataset GSE406611; B, the volcanic diagram of differentially expressed gene and expression of AQP5 gene in dataset GSE84844. * P < 0.05. SS, Sjögren syndrome; AQP5, aquaporin 5.

Spearman相关性分析显示，AQP5的表达与TLR4 (r=-0.823，P < 0.001)、MyD88 (r=-0.731，P=0.002)、NF-κB(r=-0.654，P=0.003)、TNF-α(r=-0.356，P=0.01)的表达呈明显负相关。

2.2 各组大鼠造模状态以及唾液分泌量的比较

实验过程中，Normal组大鼠摄食与饮水无异常，体重稳步增加，大鼠精神状态良好，反应敏捷，活动量较多，毛色光亮；SS组大鼠摄食量逐渐减少，饮水量逐渐增多，体重增加不明显，大鼠易躁动不安，易被激怒，毛色暗淡无光，脱毛严重；SS+NC组大鼠的表现与SS组相差不大，摄食意愿不强烈，饮水量明显增多；与之相比，SS+pc组大鼠摄食量逐渐回升，精神状态明显好转，偶见脱毛现象。
各组大鼠唾液分泌量的检测结果显示，与Normal组相比，SS组、SS+NC组、SS+pc组大鼠的唾液分泌量明显降低，与SS+NC组相比，SS+pc组大鼠的唾液分泌量明显升高，组间差异均有统计学意义(均P < 0.05)，SS组与SS+NC组相比，差异无统计意义(P>0.05)，见图 2。
图2 各组大鼠唾液分泌量的比较

Figure 2 Comparison of saliva secretion of rats in each group

* P < 0.05, compared with the Normal group; # P < 0.05, compared with the SS group. SS, Sjögren syndrome; NC, negative control; pc, rno-pcDNA3.1-AQP5.

2.3 各组大鼠颌下腺组织损伤的病理比较

HE染色结果显示，Normal组大鼠颌下腺组织中腺泡结构清晰可辨，形状规整，腺管无萎缩，管腔内无炎性介质填充，血管壁完整，细胞排列整齐，胞间界限分明；SS组大鼠颌下腺组织损伤明显严重，细胞界限不清，腺泡缺失明显，腺体萎缩严重，数量明显减少，大量的淋巴细胞浸润，腺管腔内有大量的炎性介质填充；SS+NC组大鼠的颌下腺组织损伤程度与SS组相差不大，腺泡周围形成明显的淋巴细胞灶点，细胞间隙明显扩大；与之相比，SS+pc组大鼠颌下腺组织的病理损伤明显缓解，浸润的淋巴细胞数量明显减少，腺体稍见萎缩，腺泡界限趋于清晰(图 3)。
图3 各组大鼠颌下腺组织损伤的比较(HE染色×400)

Figure 3 Comparison of submandibular gland tissue damage in each group of rats (HE staining ×400)

SS, Sjögren syndrome; NC, negative control; pc, rno-pcDNA3.1-AQP5.

2.4 各组大鼠血清中炎性因子TNF-α和IL-1β的含量

试剂盒检测结果显示，与Normal组相比，SS组、SS+NC组、SS+pc组大鼠血清中TNF-α和IL- 1β的含量明显升高，与SS+NC组相比，SS+pc组大鼠血清中TNF-α和IL-1β的含量明显降低，差异均有统计学意义(均P < 0.05)，SS组与SS+NC组相比，差异无统计学意义(P>0.05)，见图 4。
图4 各组大鼠血清中TNF-α和IL-1β的含量比较

Figure 4 The comparison of the levels of TNF-α and IL-1β in serum of rats in each group

* P < 0.05, compared with the Normal group; # P < 0.05, compared with the SS group. SS, Sjögren syndrome; NC, negative control; pc, rno-pcDNA3.1-AQP5; TNF-α, tumor necrosis factor-α; IL-1β, interleukin-1β.

2.5 大鼠颌下腺组织差异表达基因的高通量测序结果

将Normal组与SS组、SS+NC组与SS+pc组大鼠的颌下腺组织进行高通量测序，结果显示，Normal组与SS组之间出现了3 367个差异表达的基因，其中上调基因为2 383个，下调基因为984个；SS+NC组与SS+pc组之间出现了3 768个差异表达的基因，其中上调基因为2 011个，下调基因为1 757个，差异表达基因的散点图见图 5。
图5 差异表达基因的散点图

Figure 5 Scatter plot of differentially expressed genes

SS, Sjögren syndrome; NC, negative control; pc, rno-pcDNA3.1-AQP5.

为找到rno-pcDNA3.1-AQP5干预后的靶点基因，即寻找SS组对Normal组上调(下调)后的基因，并且经rno-pcDNA3.1-AQP5干预后，SS+pc组对SS+NC组下调(上调)的基因，经过R软件统计分析结果显示，与Normal组相比，SS组中TLR4、MyD88、NF-κB基因表达明显升高，rno-pcDNA3.1-AQP5升高AQP5的表达后，与SS+NC组相比，SS+pc组中的rno-TLR4、rno-MyD88、rno-NF-κB基因的表达明显下降(表 2)。因此，本研究以rno-TLR4、rno-MyD88、rno-NF-κB基因作为rno-pcDNA-3.1- AQP5干预后的靶点基因。
表2 上调和下调表达前10位的基因

Table 2 Top 10 genes of up-regulated and down-regulated expression

Normal vs. SS SS+NC vs. SS+pc
Up-regulated Score Down-regulated Score Up-regulated Score Down-regulated Score
rno-TLR4 0.993 4 rno-AQP5 0.998 2 rno-AQP5 0.999 3 rno-TLR4 0.998 7
rno-MyD88 0.990 3 rno-ALOX15B 0.976 1 rno-AGTR1 0.976 4 rno-MyD88 0.973 4
rno-NF-κB 0.985 1 rno-ADCY7 0.962 5 rno-AGTR2 0.951 7 rno-NF-κB 0.950 5
rno-ATIC 0.963 7 rno-CACNA1S 0.948 9 rno-CALCA 0.934 8 rno-SPP1 0.893 9
rno-BDKRB1 0.952 9 rno-CAMK2B 0.930 3 rno-CAT 0.930 5 rno-SIRT1 0.891 6
rno-CCL2 0.941 8 rno-NCAM1 0.922 9 rno-NOS1 0.915 3 rno-TLR2 0.887 2
rno-CCR5 0.930 7 rno-NADK 0.917 7 rno-NOS2 0.909 1 rno-HTRIA 0.885 7
rno-IRF4 0.922 4 rno-MED1 0.901 4 rno-NR3C1 0.893 3 rno-GRM5 0.876 1
rno-JUN 0.913 8 rno-MC4R 0.899 0 rno-MTOR 0.877 2 rno-GNAT3 0.863 9
rno-LCK 0.892 9 rno-NCOA1 0.887 3 rno-KIT 0.861 7 rno-ESR1 0.852 8

SS, Sjögren syndrome; NC, negative control; pc, rno-pcDNA3.1-AQP5; TLR4, Toll-like receptor 4; MyD88, myeloid differentiation factor 88; NF-κB, nuclear factor κB; ATIC, aminoimidazole carboxamide ribonucleotide transformylase; BDKRB1, bradykinin receptor B1; CCL2, CC chemokine ligand 2; CCR5, CC chemokine receptor 5; IRF4, interferon regulatory factor 4; JUN, c-jun; LCK, lymphocyte cell kinase; AQP5, aquaporin 5; ALOX15B, acid lipoxygenase 15B; ADCY7, adenylyl cyclase 7; CACNA1S, calcium channel, voltage-dependent, L-type, alpha 1S subunit; CAMK2B, calmodulin-dependent protein kinase 2b; NCAM1, neural cell adhesion molecule1; NADK, NAD kinase; MED1, mediator subunit 1; MC4R, melanocortin-4 receptor; NCOA1, nuclear receptor coactivator 1; AGTR1, angiotensin Ⅱ type 1 receptor; AGTR2, angiotensin Ⅱ type 2 receptor; CALCA, calcitonin-related peptide; CAT, catalase; NOS1, nitric oxide synthase 1; NOS2, nitric oxide synthase 2; NR3C1, glucocorticoid receptor; MTOR, mammalian target of rapamycin; KIT, c-kit; SPP1, secreted phosphoprotein 1; SIRT1, silent information regulation 1; TLR2, Toll-like receptor 2; HTRIA, hydroxytryptamin; GRM5, glutamate receptor, metabotropic 5; GNAT3, guanine nucleotide binding protein alpha transducing 3; ESR1, estrogen receptor alpha.

2.6 各组大鼠颌下腺组织中rno-AQP5、rno-TLR4、rno-MyD88、rno-NF-κB的mRNA表达

PCR结果显示，与Normal组大鼠相比，SS组、SS+NC组、SS+pc组大鼠颌下腺组织中rno-TLR4、rno-MyD88、rno-NF-κB的mRNA表达明显升高，rno-AQP5的mRNA表达明显下降；与SS组大鼠相比，SS+pc组大鼠颌下腺组织中rno-TLR4、rno-MyD88、rno-NF-κB的mRNA表达明显下降，rno-AQP5的mRNA表达明显升高，差异均有统计学意义(均P < 0.05)，SS组与SS+NC组相比差异无统计意义(P>0.05)，见图 6。
图6 各组大鼠颌下腺组织中rno-AQP5、rno-TLR4、rno-MyD88、rno-NF-κB的mRNA表达

Figure 6 The mRNA expression of rno-AQP5, rno-TLR4, rno-MyD88, and rno-NF-κB in the submandibular gland tissue of each group of rats

* P < 0.05, compared with the Normal group; # P < 0.05, compared with the SS group. SS, Sjögren syndrome; NC, negative control; pc, rno-pcDNA3.1-AQP5; rno, Rattus norvegicus; AQP5, aquaporin 5; TLR4, Toll-like receptor 4; MyD88, myeloid differentiation factor 88; NF-κB, nuclear factor κB.

2.7 各组大鼠颌下腺组织中AQP5、TLR4、MyD88、NF-κB的表达

将AQP5、TLR4、MyD88、NF-κB输入STING数据库(http://stitch.embl.de/cgi/input.plUserId=9tX1cRCf8Vqf&sessionId=zJT5054Sw2bg)，绘制蛋白质之间的作用网络(图 7)，可见在生命体内，AQP5、TLR4、MyD88、NF-κB之间存在十分复杂的作用网络，一种蛋白质表达的升高或降低，可能对其他蛋白质的表达有影响。
图7 AQP5、TLR4、MyD88、NF-κB之间的作用网络

Figure 7 Interaction network among AQP5, TLR4, MyD88, and NF-κB

AQP5, aquaporin 5; TLR4, Toll-like receptor 4; MyD88, myeloid differentiation factor 88; NF-κB, nuclear factor κB; IRAK2, interleukin-1 receptor associated kinases 2; CD289, Toll-like receptor 9; TLR3, Toll-like receptor 3; IL1R1, interleukin 1 receptor type Ⅰ; TAB2, TAK1 binding protein 2; IL1RN, interleukin-1 receptor antagonist; PELI1, pellino-1; UBE2N, ubiquitin-conjugating enzyme E2 N; UBC, ubiquitin-conjugating enzyme; LY96, lymphocyte antigen 96; TICAM1, Toll interleukin-1 receptor domain containing adaptor molecule 1; TRAF3, tumor necrosis factor-associated factor 3; TIRAP, Toll interleukin-1 receptor domain containing adaptor protein; CD40, cluster of differentiation 40; TRAF6, tumor necrosis factor-associated factor 6; IRAK4, interleukin-1 receptor associated kinases 4; UBE2V1, ubiquitin conjugating enzyme E2 V1; MAP3K7, mitogen-activated protein kinase kinase kinase 7.

Western blot检测结果显示，与Normal组大鼠相比，SS组、SS+NC组、SS+pc组大鼠颌下腺组织中TLR4、MyD88、NF-κB的表达明显升高，AQP5的表达明显下降；与SS组大鼠相比，SS+pc组大鼠颌下腺组织中TLR4、MyD88、NF-κB的表达明显下降，AQP5的表达明显升高，差异均有统计学意义(均P < 0.05)，SS组与SS+NC组相比差异无统计意义(P>0.05，图 8)。
图8 各组大鼠颌下腺组织中AQP5、TLR4、MyD88、NF-κB的表达

Figure 8 Expression of AQP5, TLR4, MyD88, and NF-κB in the submandibular gland tissue of each group of rats

* P < 0.05, compared with the Normal group; # P < 0.05, compared with the SS group. Abbreviations as in Figure 6.

3 讨论

SS患者在静息以及应激状态下的唾液分泌量明显减少，导致患者出现口腔干燥、慢性涎腺炎甚至进食障碍等系列病变，该病的主要特点为慢性、炎症性、进展性，如不能有效地干预其进展，容易引起其他脏器不可逆的病理损伤。目前，SS发病以及进展的分子机制尚未明确，临床上主要采用硫酸羟氯喹等免疫抑制剂缓解患者的不适症状，但是长期服用有明显的毒副作用[11]。因此，进一步揭示SS的分子机制，寻找可靠的治疗靶点，开发新型、安全、有效的药物对SS的临床治疗尤为重要。
以往的研究显示，SS是多种基因调控下多种信号分子和多种效应细胞共同作用的结果[12]。近年来，AQPs家族因其在SS患者的上皮细胞中有流体交换的特殊功能而受到了广泛关注，其中，AQP5具有物种进化的高度保守性，主要分布在高级哺乳动物的唾液腺、汗腺以及泪腺等上皮细胞的胞膜上，通过介导水的进出调节泪腺、唾液腺等腺体的分泌功能。Lee等[13]的研究显示，SS小鼠模型中涎腺腺泡细胞的顶端膜中AQP5的表达量明显减少，并且腺泡上皮细胞中AQP5的分布明显减弱，证实AQP5的异常表达影响了水在腺泡的跨膜转运，参与了SS口干症状的进展。Wang等[14]的研究显示，在SS模型小鼠中增强AQP5的表达，能明显改善水的转运，加快巨噬细胞的募集，抑制炎性介质TNF-α和IL-1β的释放，阻断实验动物SS病情的进展。Chivasso等[15]的研究显示，在SS小鼠模型中，上调AQP5的表达能明显改善动物唾液腺的分泌功能，阻断SS的病情进展。本研究通过对SS在线数据集GSE406611和GSE84844的统计分析显示，在SS中AQP5的表达明显降低，且AQP5的表达与TLR4、MyD88、NF-κB的表达呈负相关。本研究构建了SS模型大鼠，使用pcDNA3.1-AQP5升高了AQP5的表达后，结果显示SS+pc组大鼠的唾液分泌量明显回升，大鼠颌下腺组织的病理损伤明显缓解，血清中的TNF-α和IL-1β含量明显下降，大鼠的症状表现亦明显缓解，证实AQP5参与了SS的进展。
有研究显示，炎症性应激会促进SS的病情进展。TLR4/MyD88/NF-κB信号通路是细胞内免疫以及炎症介导信号，在细胞进行免疫应答的过程中发挥不可或缺的作用[16]。Yao等[17]的研究显示，在SS病理状态下，患者外泪腺、唾液腺等分泌腺的腺泡上皮细胞中的TLR4被激活，进而传递炎症信号至胞内MyD88，促使炎性因子、转录因子以及趋化因子募集，推动炎症信号的级联放大，使NF-κB发生核移位，诱导炎症应激加剧，导致细胞炎性损伤加重。Wang等[18]的研究显示，在以非肥胖糖尿病(non obese diabetes，NOD)/LtJ小鼠建立的SS口干模型中，抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号的传导，能明显抑制实验动物外分泌腺体中的炎症应激，升高腺体胞膜中AQP5的表达，改善SS引发的口干症状。本研究对Normal组与SS组、SS+NC组与SS+pc组大鼠的颌下腺组织进行了高通量测序，结果显示rno-TLR4、rno-MyD88、rno-NF-κB在SS中的表达明显升高，采用rno-pcDNA3.1-AQP5干预后，SS+pc组中rno-TLR4、rno-MyD88、rno-NF-κB的表达明显下降，通过PCR以及Western blot进行验证显示，过表达AQP5后，SS+pc组大鼠颌下腺组织中TLR4、MyD88、NF-κB的mRNA和蛋白的表达均明显下降。
综上所述，AQP5参与SS的进展，AQP5的表达增加能明显抑制炎症性应激，改善大鼠唾液腺的分泌功能，减轻颌下腺组织的病理损伤，这可能与抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路的传导有关。但是由于本研究的样本量较少，研究周期较短，今后应增加样本量、延长研究周期，并进行更为系统的研究，争取早日将AQP5的靶向作用应用到SS的临床治疗中。

利益冲突  所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明  陈仁利：提出研究思路，审定论文；周素娟：协助病理诊断研究；林烨、汤一榕、叶祯：收集资料，协助实验研究；朱丽秀：分析、整理数据，撰写论文。所有作者均对最终文稿进行审读并确认。

参考文献

原文顺序 | 文献年度倒序 | 文中引用次数倒序
1
Pego-Reigosa JM, Restrepo Vélez J, Baldini C, et al. Comorbidities (excluding lymphoma) in Sjögren's syndrome[J]. Rheumatology (Oxford), 2021, 60(5): 2075- 2084.

DOI

2
Imgenberg-Kreuz J, Rasmussen A, Sivils K, et al. Genetics and epigenetics in primary Sjögren's syndrome[J]. Rheumatology (Oxford), 2021, 60(5): 2085- 2098.

DOI

3
李永明, 薛鸾. AQP5在干燥综合征发病机制中的作用[J]. 中华中医药学刊, 2019, 37(10): 2369- 2372.

4
Chivasso C, Hagströmer CJ, Rose KL, et al. Ezrin is a novel protein partner of aquaporin-5 in human salivary glands and shows altered expression and cellular localization in Sjögren's syndrome[J]. Int J Mol Sci, 2021, 22(17): 9213.

DOI

5
Soyfoo MS, Nicaise C. Pathophysiologic role of interleukin-33/ST2 in Sjögren's syndrome[J]. Autoimmun Rev, 2021, 20(3): 102756.

DOI

6
Verstappen GM, Pringle S, Bootsma H, et al. Epithelial-immune cell interplay in primary Sjögren syndrome salivary gland pathogenesis[J]. Nat Rev Rheumatol, 2021, 17(6): 333- 348.

DOI

7
梅寒颖, 刘炬, 汤曾耀. 基于TLR4/MyD88/NF-κB信号通路探讨白芍总苷抑制干燥综合征模型小鼠炎症的作用机制[J]. 中药新药与临床药理, 2021, 32(9): 1293- 1299.

8
宋维海, 李琴, 茅建春. 一贯煎对干燥综合征模型大鼠及颌下腺PI3K/Akt/eNOS通路的影响[J]. 中药材, 2020, 43(7): 1721- 1725.

9
王信, 王健, 郭文静, 等. 原发性干燥综合征患者肠道菌群特点分析[J]. 南方医科大学学报, 2020, 40(7): 949- 957.

10
黄诗怡, 周广文, 朱伟, 等. 补肾化痰方对OVX诱导的骨质疏松大鼠血清LPS及TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的影响[J]. 中国实验方剂学杂志, 2021, 27(9): 70- 76.

11
Juarez M, Diaz N, Johnston GI, et al. A phase 2 randomized, double-blind, placebo-controlled, proof-of-concept study of oral seletalisib in primary Sjögren's syndrome[J]. Rheumatology (Oxford), 2021, 60(3): 1364- 1375.

DOI

12
Hajiasgharzadeh K, Khabbazi A, Mokhtarzadeh A, et al. Choli-nergic anti-inflammatory pathway and connective tissue diseases[J]. Inflammopharmacology, 2021, 29(4): 975- 986.

DOI

13
Lee SM, Lee SW, Kang M, et al. FoxO1 as a regulator of aquaporin 5 expression in the salivary gland[J]. J Dent Res, 2021, 100(11): 1281- 1288.

DOI

14
Wang D, Zhao H, Li B, et al. Mechanism of cAMP-PKA signaling pathway mediated by Shaoyao Gancao decoction (芍药甘草汤) on regulation of aquaporin 5 and muscarinic receptor 3 levels in Sjögren's syndrome[J]. Chin J Integr Med, 2020, 26(7): 502- 509.

DOI

15
Chivasso C, Nesverova V, Järvå M, et al. Unraveling human AQP5-PIP molecular interaction and effect on AQP5 salivary glands localization in SS patients[J]. Cells, 2021, 10(8): 2108.

DOI

16
Barrera MJ, Aguilera S, Castro I, et al. Dysfunctional mitochondria as critical players in the inflammation of autoimmune diseases: Potential role in Sjögren's syndrome[J]. Autoimmun Rev, 2021, 20(8): 102867.

DOI

17
Yao Y, Ma JF, Chang C, et al. Immunobiology of T cells in Sjögren's syndrome[J]. Clin Rev Allergy Immunol, 2021, 60(1): 111- 131.

DOI

18
Wang D, Zhou M, Wang Y, et al. Suppression of high-mobility group box 1 ameliorates xerostomia in a Sjögren syndrome-triggered mouse model[J]. Can J Physiol Pharmacol, 2020, 98(6): 351- 356.

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