类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种自身免疫性疾病，以滑膜增生、慢性关节炎、软骨和骨破坏为特征[1]。该病主要累及手足小关节，但大关节炎症也时有发生，除了致残和降低生活质量外，RA还会缩短预期寿命[2]。尽管一些细胞因子拮抗剂显著改善了RA的临床疗效[3]，但仍有相当比例的患者会出现持续性炎症和进行性残疾，开发新型疗法对RA的治疗至关重要。RA的细胞和分子发病机制复杂而不明确，涉及T细胞、B细胞和巨噬细胞等多种细胞类型，其中成纤维样滑膜细胞(fibroblast like synoviocytes, FLS)在RA中也发挥着关键作用[4]。正常的FLS通过产生滑液和关节软骨的某些成分以维持滑膜的生理功能。然而，RA-FLS异常增殖，并分泌各类促炎症因子，成为滑膜炎症和关节损伤的主要驱动因素[5]，因此，靶向RA-FLS是一种有潜力的RA疗法[6-7]。
泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system, UPS)管理着广泛的细胞事件。泛素特异性蛋白酶35(ubiquitin specific peptidase 35, USP35)是一种去泛素化酶，据报道USP35通过抑制铁死亡参与了肾透明细胞癌的发生发展[13]，且USP35可直接与铁蛋白(ferroportin, FPN)相互作用，发挥去泛素化酶的功能，以维持FPN蛋白质的稳定性，参与肺癌的发生发展[14]，但是USP35对RA-FLS的铁死亡是否具有抑制作用尚未见报道。为了揭示USP35能否抑制RA-FLS的铁死亡，本研究拟以铁死亡诱导分子Erastin处理RA-FLS，探索USP35对其铁死亡的调节作用，从而进一步阐明USP35在RA中扮演的角色。
1 资料与方法
1.1 主要试剂
293T细胞(货号：CL-0005)和人RA-FLS细胞(货号：CP-H248)购于武汉普诺赛生命科技有限公司，胎牛血清(货号：10099141C)、青-链霉素(货号：15140148)和高糖型达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium, DMEM；货号：11965092)购于美国Gibco公司，大肠杆菌感受态细胞(货号：CB101-01)购于天根生化科技有限公司，pKO.1-短发夹RNA嘌呤霉素质粒(pKO.1-shRNA-puro；货号：8453)、pLVX-嘌呤霉素质粒(pLVX-puro；货号：125839)、psPAX2质粒(货号：12260)和pMD2.G质粒(货号：12259)购于Addgene公司，质粒提取试剂盒(货号：DP123)购于天根生化科技有限公司，嘌呤霉素(货号：ST551)购于碧云天生物技术有限公司，慢病毒滴度酶联免疫试剂盒(货号：BF06203)购于北京博奥龙免疫技术有限公司，Erastin(货号：HY-15763)购于MedChemExpress公司，氨苄青霉素(货号：ST008)、蛋白酶抑制剂(货号：P1005)、放射免疫沉淀分析(radioimmunoprecipita-tion assay, RIPA)裂解缓冲液(货号：P0013C)、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)蛋白浓度检测试剂盒(货号：P0009)、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)制胶试剂盒(货号：P0012A)、SDS-PAGE电泳液(货号：P0014A)、增强化学发光(enhanced chemiluminescence, ECL)检测试剂盒(货号：P0018S)、聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride, PVDF)膜(货号：FFP24)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA；货号：ST025)、细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8, CCK8; 货号：C0037)、GSH和氧化型谷胱甘肽(glutathione sulfide，GSSG)检测试剂盒(货号：S0053)购于碧云天生物技术有限公司，核糖核酸(ribonucleic acid, RNA) 提取试剂盒(货号：R401-01)、逆转录试剂盒(货号：R222-01)、实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qPCR)检测试剂盒(货号：Q431-02)购于南京诺唯赞生物科技公司，兔抗SLC7A11抗体(货号：26864-1-AP)、兔抗GPX4抗体(货号：30388-1-AP)、兔源肌动蛋白(actin)抗体(货号：20536-1-AP)、辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔IgG(货号：SA00001-2)购于武汉三鹰生物技术有限公司，ROS检测试剂盒(货号：50101ES01)购于翌圣生物科技(上海)股份有限公司，丙二醛(malondialdehyde, MDA)检测试剂盒(货号：BC0020)、亚铁离子(Fe2+)含量检测试剂盒(货号：BC5415)购于北京索莱宝科技有限公司。
1.2 细胞培养
293T细胞和人RA-FLS细胞培养于添加10%(体积分数)胎牛血清及1%(体积分数)青-链霉素的DMEM培养基中，在37 ℃恒温培养箱5% (体积分数)CO2的条件下培养。实验所用的细胞均为5代以内的细胞。
1.3 构建pKO.1-shUSP35-puro质粒
根据USP35基因序列，设计特异性靶向USP35的shRNA序列(正向5′-3′：CCGGCATGCTATGTCAACAGCATCCCTCGAGGGATGCTG TTGACATAGC- ATGTTTTT；逆向5′-3′：AATTAAAAACATGCTATGTCAACAGCATCCCTCGAGGGATGCTGTTGACATAGC-ATG)。将设计好的shRNA序列引物进行退火，形成双链DNA。将退火后的双链shRNA片段插入到pKO.1-shRNA-puro载体的多克隆位点中。随后将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中，涂布在含有氨苄青霉素的卢里亚-伯塔尼(Luria-Bertani, LB)固体培养基平板上，37 ℃培养过夜。挑取单克隆进行qPCR鉴定和测序，以确认插入序列的正确性，随后提取质粒。
1.4 构建pLVX-USP35-puro质粒
根据USP35基因序列，设计含有合适酶切位点的引物(正向：5′-3′：TAGAGAATTCGGATCCATGGACAAGATCTTGGAGGCGGTG；逆向：5′-3′：GCTTCCATGGCTCGAGTTAGAAGACCAGTCTGTGGAAG-TC)，通过qPCR扩增USP35的全长cDNA。将扩增的USP35 cDNA插入到pLVX-puro载体的多克隆位点中。随后将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中，涂布在含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，37 ℃培养过夜。筛选单克隆并通过qPCR和测序鉴定插入片段的正确性后提取质粒。
1.5 稳转株的构建
将质粒pKO.1-USP35 shRNA-puro、pKO.1-NC shRNA-puro、pLVX-puro和pLVX-USP35-puro分别与慢病毒包装质粒(psPAX2质粒和pMD2.G质粒)共转染到293T细胞中。培养48 h后收集细胞上清液，于4 ℃，4 000×g离心10 min，除去细胞碎片，并以0.45 μm滤器过滤上清液，获得的滤液含有慢病毒, 利用慢病毒滴度酶联免疫试剂盒检测慢病毒的滴度。培养RA-FLS细胞，待长至80%左右，用慢病毒进行感染。感染48 h后，利用嘌呤霉素筛选，获得相应的稳转细胞株。
1.6 细胞分组及Erastin诱导干预
体外培养RA-FLS，用慢病毒载体感染以构建稳定敲低USP35的细胞系(short hairpin ribonucleic acid of USP35，shUSP35)和其对照细胞系(negtive control of short hairpin ribonucleic acid，shNC)，以及稳定过表达USP35的细胞系(overexpression of USP35，USP35 OE)和其对照细胞系(Vector)。为了探究USP35在铁死亡调控中的作用，使用1 μmol/L Erastin诱导RA-FLS细胞构建铁死亡模型。将细胞分为6组，第一组是shNC细胞，第二组是用Erastin处理shNC细胞(shNC+Erastin)，第三组是用Erastin处理shUSP35细胞(shUSP35+Erastin)，第四组是Vector细胞，第五组是用Erastin处理vector细胞(Vector+Erastin)，第六组是用Erastin处理USP35 OE细胞(USP35 OE+Erastin)。除shNC组和Vector组外，其余组细胞均采用1 μmol/L的Erastin处理24 h，24 h后收集细胞用于后续实验。
1.7 CCK8实验
将RA-FLS细胞接种于96孔板中(3 000个细胞/孔)，按照上述实验的设置分为6个组，接种24 h后，添加1 μmol/L的Erastin处理24 h，然后每孔加入10 μL CCK8继续在37 ℃、5% CO2条件下孵育2 h，结束孵育时使用酶标仪检测每孔450 nm处光密度值，计算细胞存活率。
1.8 qPCR实验
培养结束后，收集RA-FLS细胞，按照南京诺唯赞生物科技公司RNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA，并进行RNA逆转录合成cDNA。以18S基因的表达作为内参照，应用qPCR检测USP35的mRNA水平。采用相对定量2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。引物序列：(1) USP35：正向5′-AGAGAACTTCCTCTCCGCATCC-3′；逆向5′-CTGGACTGCTTGAGTTTCTGG-3′；(2)18S：正向5′-ACCCGTTGAACCCCATTCGTGA-3′；逆向5′-GCCTCACTAAACCATCCAATCGG-3′。
1.9 蛋白免疫印迹实验(Western blotting)
收集细胞使用含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液于冰上进行裂解。随后，在4 ℃下10 000×g离心20 min，收集上清液。用BCA试剂盒测定上清液中的蛋白质浓度。将每个样品中10 μg的变性蛋白质加入到10%(体积分数) SDS-PAGE凝胶中进行电泳分离，然后转移到PVDF膜上，在室温条件下用5%(质量分数) BSA封闭2 h，随后在SLC7A11 (1 ∶ 1 000)、GPX4 (1 ∶ 1 000)和Actin(1 ∶ 40 000)抗体中于4 ℃孵育过夜，二抗(1 ∶ 5 000)室温孵育2 h。最后，用ECL检测试剂盒在电子压片成像仪中观察和记录信号。
1.10 ROS检测实验
将RA-FLS细胞接种于6孔板中，按照上述实验的设置分为6个组，添加1 μmol/L的Erastin处理24 h，按照ROS检测试剂盒说明步骤检测细胞ROS的含量。简言之，将经过指定处理的RA-FLS细胞按1.0×106/mL密度重悬于无血清培养液中，然后与10 μmol/L 2’, 7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯(2’, 7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate, DCFH-DA)在黑暗条件下孵育20 min，每隔3~5 min颠倒混匀。然后用无血清培养基洗涤细胞，去除游离的DCFH-DA。最后，将细胞重悬于无血清培养基中，用流式细胞仪进行分析。
1.11 MDA检测实验
将RA-FLS细胞接种于6孔板中，按照上述实验的设置分为6个组，添加1 μmol/L的Erastin处理24 h，按照MDA检测试剂盒说明步骤检测细胞MDA的含量。简言之，收集经过指定处理的RA-FLS细胞，按照每5×106细胞加入1 mL提取液，用超声波破碎细胞，8 000×g，4 ℃离心10 min，取上清。按照说明书的体系进行加样混合，在100 ℃水浴中保温60 min，随后10 000×g，常温，离心10 min。取上清至1 mL玻璃比色皿中，使用微孔板阅读测定各样本在450 nm、532 nm和600 nm处的光密度，根据公式计算MDA含量。
1.12 GSH/GSSH检测实验
将RA-FLS细胞接种于6孔板中，按照上述实验的设置分为6个组，添加1 μmol/L的Erastin处理24 h，按照GSH和GSSG检测试剂盒说明步骤检测细胞GSH和GSSH的含量。简言之，收集经过指定处理的RA-FLS细胞，用PBS洗涤细胞，离心收集细胞，吸尽上清。往细胞沉淀里加入3倍体积的蛋白去除液，充分涡旋。然后利用液氮和37 ℃水浴对样品进行两次快速的冻融。4 ℃放置5 min，4 ℃，10 000×g离心10 min，取上清。使用96孔板，依次加入样品或标准品，混匀。加入150 μL总GSH检测工作液后，混匀，25 ℃孵育5 min。加入50 μL 0.5 g/L还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced form, NADPH)溶液，混匀，孵育25 min，用酶联免疫吸附测定仪测定412 nm处光密度值，根据公式计算GSH和GSSH的含量。
1.13 Fe2+检测实验
将RA-FLS细胞接种于无菌盖玻片上，按照上述实验的设置分为6个组，添加1 μmol/L的Erastin处理24 h，按照Fe2+含量检测试剂盒说明检测细胞Fe2+含量。简言之，收集经过指定处理的RA-FLS细胞，将细胞进行冰浴超声波破碎，然后10 000×g，4 ℃离心10 min，取上清液。按照说明书稀释标准溶液，并使用1.5 mL离心管按照说明书进行加样，充分涡旋震荡5 min之后12 000×g常温离心10 min，小心吸取上层无机相200 μL于96孔板，测定593 nm处光密度值，根据公式计算Fe2+含量。
1.14 统计学分析
应用GraphPad Prism 9.0软件进行统计分析及作图，结果以均数±标准差表示。组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，进一步的组间两两比较采用Tukey’s检验。P＜0.05为差异有统计学意义。所有实验都是独立重复了三次，除Western blotting外，其他实验每组还包含三次技术重复，其中CCK8包含四次技术重复。
2 结果
2.1 沉默USP35加剧Erastin对RA-FLS细胞活力的抑制
为了探索USP35对RA-FLS的影响，本研究首先构建了USP35稳定敲低和稳定过表达的RA-FLS，qPCR结果显示，与shNC+Erastin组相比，shUSP35 +Erastin组USP35 mRNA表达显著降低(P＜0.05)，而与Vector+Erastin组相比，USP35 OE+Erastin组mRNA表达显著升高(P＜0.001，图 1A)。随后，检测USP35对RA-FLS细胞活力的影响，CCK8实验结果显示，Erastin诱导24 h后，RA-FLS细胞活力显著降低(P＜0.001)，沉默USP35后细胞活力进一步降低(P＜0.001)，而USP35过表达后细胞活力显著增强(P＜0.001，图 1B)。
图1 USP35对RA-FLS细胞活力的影响(n=3)Figure 1 Influence of USP35 on the viability of RA-FLS cells (n=3) *P < 0.05, ***P < 0.001. A, qPCR detection of USP35 mRNA expression; B, CCK8 detection of RA-FLS cell viability. shNC, negtive control of short hairpin ribonucleic acid; shUSP35, short hairpin ribonucleic acid of USP35; USP35 OE, overexpression of USP35; USP35, ubiquitin-specific protease 35; qPCR, quantitative real-time PCR; CCK8, cell counting kit-8; RA-FLS, rheumatoid arthritis-fibroblast like synoviocytes; ns, no statistic. |
2.2 USP35可降低Erastin诱导RA-FLS细胞中Fe2+的水平
为了直接评估USP35对RA-FLS铁死亡的影响，本研究检测了几个铁死亡相关指标。通过检验各组细胞中Fe2+水平，发现Erastin诱导24 h后，RA-FLS细胞Fe2+水平显著提升，沉默USP35后细胞Fe2+水平进一步升高(P＜0.001)，而USP35过表达后细胞Fe2+的含量显著下降(P＜0.05，图 2)。
2.3 USP35抑制Erastin诱导RA-FLS细胞的ROS和MDA水平，并提升GSH/GSSG比值
通过对这些细胞中ROS、MDA、GSH和GSSG的水平的检测，发现Erastin诱导24 h后，RA-FLS的ROS和MDA水平显著上升，GSH/GSSG比值显著降低。沉默USP35导致细胞内ROS和MDA的含量进一步升高(P＜0.001，P＜0.05)，GSH/GSSG的降低更显著(P＜0.05)。相反，USP35过表达后，细胞ROS和MDA水平显著降低(P＜0.001，P＜0.05)，而GSH/GSSG升高(P＜0.05，图 3)。
图3 RA-FLS细胞中活性氧、丙二醛、谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽的含量检测(n=3)Figure 3 Detection of ROS, MDA, GSH, and GSSG levels in RA-FLS cells (n=3) *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. A, cellular ROS assay; B, cellular MDA assay; C, cellular GSH assays; D, cellular GSSG assays; E, cellular GSH/GSSG assays. MFI, mean fluorescent intensity; DCF, 2', 7'-dichlorofluorescein; ROS, reactive oxygen species; MDA, malondialdehyde; GSH, glutathione; GSSG, glutathione sulfide; Other abbreviations as in Figure 1. |
2.4 USP35抑制RA-FLS细胞SLC7A11、GPX4蛋白表达
采用Western bloting在分子水平上探索USP35在RA-FLS细胞中对铁死亡通路相关蛋白GPX4和SLC7A11表达量的影响，结果显示，Erastin诱导后，RA-FLS细胞GPX4和SLC7A11蛋白表达显著降低，沉默USP35后加剧了Erastin对GPX4和SLC7A11蛋白表达的抑制，而USP35过表达则显著提升了这些细胞中GPX4和SLC7A11的表达水平(图 4)。
3 讨论
本研究以Erastin诱导的RA-FLS为模型，探索USP35对铁死亡的影响，结果发现，USP35沉默进一步降低Erastin诱导的RA-FLS的细胞活力，而过量USP35显著提高细胞活力，说明USP35可抑制Erastin对这些细胞的伤害；沉默USP35会加剧Erastin诱导的RA-FLS细胞中Fe2+、ROS和MDA水平的升高，而过量的USP35起相反效果，这些指标说明USP35可抑制RA-FLS细胞由Erastin诱发的铁死亡。铁死亡不仅与铁代谢和脂质过氧化有关，还与细胞内的抗氧化系统密切相关，GSH/GSSG是评估细胞抗氧化能力的重要指标。本研究中，我们发现沉默USP35导致GSH/GSSG降低，而过表达USP35则增加了GSH/GSSG，这一结果表明，USP35可能通过调控细胞内的抗氧化系统影响RA-FLS铁死亡的发生。RA的发病机制与氧化应激、促炎症介质、各种酶和蛋白质之间的失衡和衰减相关，而UPS介导的蛋白泛素化降解是细胞内蛋白质非溶酶体蛋白水解的主要途径，广泛调节包括细胞周期、分裂、凋亡和迁移在内的各种生物学进程，这一系统的异常会导致细胞功能失调，逐渐引发RA等各类疾病[15]。去泛素化酶(deubiquitinating enzymes，DUB)是UPS的核心调节因子之一，可平衡泛素信号转导，其中USP是最大的DUB亚家族，在调节免疫细胞功能、调节免疫反应等方面发挥关键作用[16]。另外，USP通过直接或间接调控铁积累或脂质过氧化来协调复杂的铁死亡。例如，敲除USP11可以抑制铁死亡，进而促进脊髓缺血再灌注损伤小鼠功能恢复[17]。此外，在经缺血/再灌注处理的大鼠心脏中，USP7的上调可通过激活p53/转铁蛋白受体1通路促进铁蛋白沉积[18]。USP35在肿瘤细胞中能够通过去泛素化作用稳定铁死亡调控因子，从而影响铁死亡的发生[13-14]，但是，USP35是否抑制RA-FLS的铁死亡尚未报道。
为了进一步探索USP35抑制RA-FLS细胞铁死亡的机制，本研究检测了铁死亡关键蛋白SLC7A11和GPX4的表达，结果发现在这些细胞中USP35的表达与SLC7A11和GPX4蛋白水平正相关。以上结果说明，USP35在RA-FLS细胞中抑制铁死亡的机制可能与增加SLC7A11和GPX4表达相关。作为细胞抗脂质过氧化的关键酶，目前普遍认为GPX4失活是铁死亡的先决条件[19]。当脂质过氧化发生时，细胞会利用抗氧化系统来对抗这一过程并保持平衡，抗氧化系统主要由胱氨酸/谷氨酸抗转运体和GPX4组成。胱氨酸/谷氨酸抗转运体由SLC7A11和SLC3A2组成，可将谷氨酸运出细胞，将胱氨酸运入细胞并将其转化为半胱氨酸，成为GSH合成的底物。GPX4是唯一具有将GSH转化为GSSG并同时将脂质过氧化物还原为相应醇类功能的酶[20]，因此，GPX4和SLC7A11被认为是铁死亡的关键调节因子[19]。目前有关铁死亡的研究多集中于肿瘤、血液系统和神经系统疾病中，但最近的一些研究结果表明，铁死亡与炎症性关节炎的发生和发展密切相关[21]。选择性地靶向调控FLS的铁死亡，对于治疗与FLS活化失调相关的RA具有潜在价值[22]。
综上所述，本研究揭示了USP35在RA-FLS中的功能，发现其对RA-FLS的铁死亡具有抑制作用，这一发现可加深人们对RA中铁死亡的认知，并为RA治疗提供新的靶点。值得注意的是，USP35是否直接调节SLC7A11和GPX4两个蛋白的泛素化和稳定性尚不明确。除了直接调控，USP35还可以通过影响调控这两个蛋白稳定性的其他因子实现对其表达水平的间接调控。我们将在后续的研究中更深入探讨这些可能性，从而更全面揭示USP35抑制RA-FLS铁死亡的分子机制。
