缺血性脑卒中(ischemic stroke，IS)是我国居民首位的致死、致残原因[1]，呈现显著的家族聚集性特征，其发病涉及遗传与环境因素之间的复杂作用[2]。既往研究显示，由亲代基因型所塑造的家庭环境(如生活方式等)对心脑血管健康具有持续性影响，即使个体成年后脱离该环境，IS发病风险仍可升高约25%[3]。随着对基因-环境复杂作用研究的不断深入，遗传培育效应这一概念近年来被提出，用以阐释亲代基因型通过塑造家庭教养环境、行为模式等“培育”因素，对子代表型产生的间接作用[4]。这种效应近期在教育成就、2型糖尿病、精神疾病、肥胖等多种复杂性状中被相继报道[4-13]，且其效应量随子代年龄增长呈累积性放大[14]。值得注意的是，2024年的一项养子研究为IS的遗传培育效应提供了关键证据，在排除养子女携带养父母IS风险位点的生物遗传影响后，单纯暴露于患病养父母所营造的家庭环境，亦可使养子女成年后的IS风险增加约41%[15]，这提示亲代养育行为与生活方式对子代IS发病具有独立于生物遗传的显著影响，遗传培育效应可能在IS的病因组分中占据重要位置。
然而，由于IS属于晚发性疾病，收集父母双方的基因组信息面临极大挑战，导致当前针对IS遗传培育效应的实证研究仍十分匮乏。基于此，本研究依托持续随访的家系队列资源[16]，探索IS的遗传培育效应。候选基因策略依托明确的生物学假设，在初步探索特定效应时更为高效精准[17-18]，因此，本研究聚焦近期亚洲人群新发现的IS易感基因簇——CTNNA基因家族[19-20]，该基因家族编码的α-连环蛋白深度参与脑缺血病理过程[21-23]，并广泛涉及多巴胺奖赏及记忆等神经环路[24-25]，影响吸烟、饮酒等与IS相关的行为[26-28]。近期的影像遗传学研究还发现，母亲教育程度等家庭养育环境在CTNNA2影响子代神经发育的过程中发挥关键作用[29]，提示CTNNA基因家族可能通过亲代行为及家庭环境对子代产生遗传培育效应。本研究旨在以该基因家族为切入点，评估亲代基因型对子代IS风险的遗传培育效应，并进一步解析该效应的父源与母源差异，为深化认识IS发生中遗传与环境的复杂作用提供科学依据。
1 资料与方法
1.1 研究设计
本研究采用家系设计，依据孟德尔遗传定律推断父母未传递给子代的等位基因，评估其对子代IS的遗传培育效应。
1.2 研究对象
研究对象来源于“北方农村地区居民常见慢性非传染性疾病家系队列研究”[16]，调查现场位于北京市房山区9个乡镇。研究对象基本资料已于2005年6月至2017年8月收集完成，并持续随访。该队列已获得北京大学生物医学伦理委员会批准(IRB00001052-13027)。
本研究以核心家系及同胞对等家系人群为研究对象，为保证后续术语使用统一，同胞对中的个体亦统一称为“子代”。
家系研究对象的纳入标准：(1)子代年龄≥ 18周岁；(2)子代疾病史相关信息完整；(3)所有家系成员的外周血生物样本均保存完整；(4)家系成员均完成全基因组芯片检测；(5)家系成员均签署知情同意书。排除标准：(1)家系成员患有心脑血管相关的单基因遗传病，如伴有皮质下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病(cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy，CADASIL)等；(2)子代关键信息缺失或存在逻辑错误；(3)子代疾病史的现场调查信息与医院病历核对结果不一致；(4)家系成员任一人的外周血生物样本质量及数量不合格；(5)家系成员任一人的全基因组芯片检测质量控制不合格。
根据以上纳入、排除标准，我们共纳入包含1 005名子代个体的530个家系开展研究，其中包括核心家系143个，其余可推断亲本基因型的同胞对等家系387个。
1.3 流行病学调查资料的收集
采用面对面的调查方式，由经过统一培训的调查员采用标准化调查问卷对研究对象的一般人口学特征、疾病史、家族史、用药史、行为生活方式等进行调查。体格检查由经过培训的调查员和护士进行。
1.4 IS的诊断与分型
IS的诊断信息通过现场问卷调查、医院病历资料核查等多种途径进行确认。现场问卷获得研究对象经二级及以上医院的诊断信息后，项目组前往就诊医院获取研究对象的病历资料(包括就诊记录及影像学等辅助检查结果)，随后由项目组内有资质的神经内科医生根据病历信息，对研究对象的IS状态进行确认并进行TOAST分型[TOAST是缺血性脑卒中根据病因进行的国际通用分类标准，即治疗急性缺血性脑卒中试验(Trial of Org 10172 in Acute Stroke Treatment)]。未患IS的研究对象需经过非卒中状态确证问卷确认[30]。
1.5 基因型检测
采集研究对象的空腹静脉血，采用盐析法提取DNA，以紫外分光光度法测定DNA浓度。使用Illumina ASA芯片测定等位基因，使用Shapeit2软件进行基因型定相[31]，经质量控制后获得基于原始基因芯片数据的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)共500 599个。采用IMPUTE 2软件[32]，以千人基因组计划的三期数据为参考模板进行等位基因填补[33]，对填补后的数据进行严格质量控制，剔除了填补信息分数(imputation information score, INFO) < 0.7、缺失率>5%、次要等位基因频率(minor allele frequency, MAF) < 1%的SNPs，最终获得5 210 112个SNPs位点。
本研究聚焦于CTNNA基因家族的三个基因，分别为CTNNA1 (chr5: 137946656-138270723)、CTNNA2 (chr2: 79412357-80875905)、CTNNA3 (chr10: 67672276-69455927)。为避免连锁不平衡(linkage disequilibrium, LD)对统计效能的影响，仅纳入独立SNPs(窗口100 kb，滑动步长5 kb，LD值r2 < 0.6)进行分析[34]，三个基因分别包含70、473和579个SNPs，其中基于原始基因芯片的SNPs分别为24、473、188个。
1.6 统计学分析
采用均值±标准差或频数(构成比)对子代研究对象的基本情况进行描述。利用Snipar软件包(https://github.com/AlexTISYoung/SNIPar)识别亲代未传递给子代个体的等位基因[35-36]，通过构建线性混合效应模型识别其对子代IS的遗传培育效应，并进一步纳入父亲与母亲各自未传递的等位基因，解析父源与母源的遗传培育效应。
1.6.1 识别亲代未传递基因型
在具备完整双亲基因型信息的核心家系中，通过与子代基因型比对，识别亲代未传递的等位基因。对于双亲基因型信息不完整的家系(如不完整核心家系或同胞对)，首先依据孟德尔遗传定律推断亲本平均基因型，再与子代基因型比对，确定未传递的等位基因[35-36]。例如，在缺少父母一方基因型信息的不完整核心家系中，通过父母一方的基因型信息及所有子代个体的基因型信息，推断缺失的父母一方的基因型；在缺少父母双方基因型信息的同胞对中，利用同胞对共享父母各一半遗传信息的原理推至父母双方的平均基因型。为确保上述推断结果的可靠性，本研究对推断结果进行了全基因组的质量评估，结果显示，在所有SNPs中，高质量SNPs(基因分型错误率 < 0.1)占比达87.56%，整体平均孟德尔错误率仅为0.83%，表明推断质量良好且可靠，可进行后续分析。
1.6.2 评估遗传培育效应
构建子代患病状态与包含子代等位基因与父母未传递等位基因的线性混合效应模型[35-36]：$ Y_{i j}=\beta_{n T} \overline{g_{N T}}+\delta g_{i j}+{Cov}_{i j}+\varepsilon_{i j}$ ，其中，Yij表示家系j中子代个体i的表型(患病状态)；gij表示家系j中子代个体i的等位基因；$ \overline{g_{N T}}$ 表示家系j中父母未传递等位基因组成的基因型平均值；βnT表示家系j中由父母未传递等位基因对子代表型的遗传培育效应；δ表示排除了遗传培育效应后，子代自身等位基因对自身表型的遗传效应，后文统称为个体遗传效应；Covij表示子代个体的年龄、性别等协变量，εij表示随机误差。此外，为进一步理解遗传培育、个体遗传两类效应的特征，本研究还构建了子代患病状态与子代等位基因的线性模型以计算总遗传效应，用以综合反映遗传培育效应和个体遗传效应[4]，该模型为：Yij=βTGEsgij+Covij+εij，其中，βTGEs表示总遗传效应，为遗传培育和生物遗传的叠加效应。基于上述模型，可获得父母未传递的CTNNA等位基因对子代IS风险的遗传培育效应(βnT)、子代自身CTNNA等位基因的个体遗传效应(δ)，以及未考虑遗传培育效应时的总遗传效应(βTGEs)。统计学显著性阈值均设定为P < 0.01。
1.6.3 评估父源及母源的遗传培育效应
针对已识别出的具有遗传培育效应的SNPs，进一步区分父亲与母亲各自未传递等位基因的遗传培育效应，构建模型如下：Yij=βnpgpNT+βnmgmNT+δgij+Covij+εij，其中，gpNT和gmNT分别表示家系j中父亲和母亲未传递给子代的等位基因；βnp和βnm分别表示家系j中由父亲和母亲未传递给子代的等位基因对子代表型产生的父源和母源的遗传培育效应。统计学显著性阈值设定为P < 0.05。此外，构建统计量$\eta\left(\eta=\left|\frac{\beta_{n p}}{\beta_{n m}}\right|\right) $ ，以评估父源和母源遗传培育效应的相对大小。
2 结果
2.1 研究对象的基本特征
研究共纳入1 005名子代研究对象，来自530个家系，其中IS患者308例(30.6%)。相较于未患病者，IS患者的平均年龄较大，男性比例较高，高血压及高脂血症的患病率较高(P < 0.05，表 1)。
表1 子代研究对象的基本特征Table 1 Basic characteristics of offsprings |
| Items | Offsprings without IS (n=697) | Offsprings with IS (n=308) | Total Offsprings (n=1 005) | P value |
| Age/years, $\bar x \pm s$ | 54.5±10.8 | 60.5±7.8 | 56.3±10.4 | < 0.001 |
| Gender, n (%) | 0.002 | |||
| Male | 386 (55.4) | 203 (65.9) | 589 (58.6) | |
| Female | 311 (44.6) | 105 (34.1) | 416 (41.4) | |
| Marital status, n (%) | 0.961 | |||
| Married | 612 (89.3) | 267 (89.0) | 879 (89.2) | |
| Other status | 73 (10.7) | 33 (11.0) | 106 (10.8) | |
| Educational status, n (%) | < 0.001 | |||
| Primary school and below | 234 (34.1) | 148 (48.8) | 382 (38.6) | |
| Junior high school | 313 (45.6) | 121 (39.9) | 434 (43.9) | |
| Senior high school and above | 139 (20.3) | 34 (11.2) | 173 (17.5) | |
| Hypertension, n (%) | 340 (57.1) | 217 (73.3) | 557 (62.4) | < 0.001 |
| Diabetes mellitus, n (%) | 157 (26.7) | 89 (29.7) | 246 (27.7) | 0.393 |
| Hyperlipidemia, n (%) | 181 (34.9) | 132 (50.4) | 313 (40.1) | < 0.001 |
| BMI/(kg/m2), $\bar x \pm s$ | 26.3±3.8 | 26.3±3.6 | 26.3±3.5 | 0.780 |
IS, ischemic stroke; BMI, body mass index. |
2.2 遗传培育效应
在CTNNA基因家族中，共识别出16个与IS相关、具有遗传培育效应的独立SNPs，其中9个位于CTNNA2，6个位于CTNNA3，1个位于CTNNA1。这些SNPs的遗传培育效应估计值(βnT)为-0.282~0.480(表 2)，其中，位于CTNNA2的rs117741773呈现出最强的遗传培育效应(0.480; 95%CI: 0.278~0.682)，此外，位于CTNNA1的rs76210266(0.362; 95%CI: 0.108~0.615)和位于CTNNA2的rs78592910(0.361; 95%CI: 0.136~0.586)同样表现出了较强的遗传培育效应。
表2 具有遗传培育效应的16个IS易感位点Table 2 Sixteen SNPs with genetic nurture effects on IS |
| SNPs | A1 | A2 | MAF | βnT (95%CI) | P value |
| CTNNA1 | |||||
| rs76210266 | T | C | 0.011 | 0.362 (0.108, 0.615) | 5.21×10-3 |
| CTNNA2 | |||||
| rs117741773 | A | G | 0.011 | 0.480 (0.278, 0.682) | 3.29×10-6 |
| rs78592910 | A | C | 0.011 | 0.361 (0.136, 0.586) | 1.64×10-3 |
| rs55767232 | G | A | 0.019 | 0.243 (0.067, 0.419) | 6.84×10-3 |
| rs868032 | C | T | 0.496 | 0.065 (0.020, 0.111) | 4.68×10-3 |
| rs546179372 | T | TA | 0.355 | 0.065 (0.016, 0.115) | 9.90×10-3 |
| rs6547309 | C | A | 0.408 | 0.068 (0.019, 0.116) | 5.58×10-3 |
| rs149752934 | T | C | 0.019 | -0.282 (-0.452, -0.113) | 1.11×10-3 |
| rs181654218 | T | C | 0.016 | -0.272 (-0.465, -0.079) | 5.71×10-3 |
| rs10166591 | C | T | 0.373 | -0.063 (-0.111, -0.016) | 8.67×10-3 |
| CTNNA3 | |||||
| rs16924512 | G | A | 0.013 | 0.239 (0.067, 0.412) | 6.50×10-3 |
| rs79767344 | C | T | 0.027 | 0.206 (0.062, 0.351) | 5.21×10-3 |
| rs78184651 | C | T | 0.015 | -0.267 (-0.460, -0.074) | 6.79×10-3 |
| rs78365177 | T | C | 0.021 | -0.250 (-0.417, -0.083) | 3.37×10-3 |
| rs78279947 | C | G | 0.020 | -0.238 (-0.416, -0.061) | 8.56×10-3 |
| rs139947562 | A | G | 0.026 | -0.233 (-0.380, -0.085) | 2.01×10-3 |
IS, ischemic stroke; SNPs, single nucleotide polymorphisms; A1, effect allele; A2, reference allele; MAF, minor allele frequency; βnT, genetic nurture effects; CI, confidence interval. |
为进一步阐明遗传培育效应的作用特征，本研究还估计了上述16个SNPs对IS风险的个体遗传效应与总遗传效应，并对以上三类效应特征进行比较(图 1)，结果显示，在上述16个呈现遗传培育效应的SNPs中，仅4个位点同时表现出具有统计学意义的个体遗传效应。值得注意的是，所有SNPs的遗传培育效应和个体遗传效应的效应估计值均呈现相反的作用方向，两类效应相互抵消，导致总遗传效应几近消失。
2.3 父源与母源遗传培育效应
针对上述16个SNPs进一步开展亲本来源特异性分析，结果显示共12个SNPs表现出单一亲本来源的遗传培育效应，其中，4个SNPs(rs181654218、rs117741773、rs55767232和rs78592910)仅表现出父源特异性遗传培育效应，所有位点均位于CTNNA2，效应估计值为-0.298~0.945；另有8个SNPs仅表现出母源特异性遗传培育效应，效应估计值为-0.489~0.602，其中1个SNPs(rs76210266)位于CTNNA1，3个(rs546179372、rs6547309、rs149752934)位于CTNNA2，4个(rs16924512、rs78184651、rs78365177、rs78279947)位于CTNNA3。未观察到同时具有父源与母源遗传培育效应的SNPs(图 2)。
针对上述12个仅呈现单一亲本特异性遗传培育效应的SNPs，我们进一步进行了不同亲本来源的效应估计值对比分析，结果显示，同一位点父源与母源遗传培育效应的作用方向基本一致，但二者的效应量相对大小存在显著的量级差异。上述4个仅表现为父源特异性效应的位点，均呈现父源效应估计值显著高于母源效应的规律，亲本效应比值(η)为1.21~63.83；上述8个仅表现为母源特异性效应的位点，均呈现母源效应估计值显著高于父源效应的特征，亲本效应比值(η)为0.03~0.44(图 2)。
3 讨论
值得注意的是，遗传培育效应的作用方向均与个体遗传效应相反，致使总遗传效应均趋近于零。这种现象与Young等[35]的研究结果一致，若不纳入父母基因型信息，仅基于个体层面数据将无法有效拆分各类遗传效应组分，进而可能低估或忽视这些SNPs对IS发生的潜在影响。鉴于遗传培育效应反映了遗传与环境之间的复杂作用，对阐明复杂疾病的病因具有重要价值，因此准确识别与解析该效应组分，是精准定位复杂疾病易感基因的必要前提。本研究发现部分SNPs(rs117741773、rs78592910、rs149752934和rs139947562)同时表现出显著的遗传培育效应与个体遗传效应，表明遗传因素对子代IS风险的影响并非单一途径，而是基因与环境共同作用的结果，这提示即便对于具有直接生物学效应的位点，由家庭环境介导的遗传培育效应仍是风险传递的重要路径，从而为基因与环境在IS发生发展中的复杂机制提供了有力证据。
此外，鉴于父母在塑造家庭环境中的角色差异[37-38]，为精细解析父源与母源特异性遗传培育效应的相对贡献，本研究进一步开展了亲本来源特异性分析，发现父母双方的效应方向相似但强度存在一定差异。研究发现两类位点无重叠，表明父母双方可能经由不同的遗传位点发挥遗传培育效应，同时，两类位点的亲源特异性效应均表现出较强的异质性，即特定亲源位点的亲本自身效应强度明显高于另一亲本，提示父母通过CTNNA基因家族影响子代IS的路径存在明显的亲源不对称性。这种不对称性可能源于父母在行为模式及家庭环境塑造中的角色差异，既往研究表明，母亲往往更深度地参与子代养育及社会化过程[39]，对子代高危行为(如吸烟、饮酒)的发生发展具有重要影响[37]，这一现象在中国传统的社会文化背景下尤为显著[40-41]。本研究以吸烟、饮酒为中介变量进行了初步探索，结果显示母源位点(rs6547309、rs76210266、rs149752934)在两者中表现出显著的中介效应，而父源位点均未检测出中介效应，与上述假设相符。然而，遗传培育效应的具体作用模式及亲源特异性位点的作用机制仍有待深入探索。
本研究评估了CTNNA基因家族对IS的遗传培育效应，并比较了父源与母源效应的异同，为解析IS的遗传与环境复杂病因提供了重要线索。本研究仍存在一定局限性：(1)遗传培育效应属于基因-环境相互作用，其效应依赖于特定家庭环境，且由于人群行为模式深受社会文化背景塑造，致使该效应在不同人群中存在较大差异，既往对于体重指数的研究在冰岛[4]、荷兰[5]、英国[35]等不同人群的遗传培育效应估计值不一致亦印证了这一点。本研究聚焦于中国北方农村人群，其独特的社会人口学特征及疾病风险分布一定程度上限制了结果的外推性。然而，中国北方农村社会家庭结构紧密、亲属互动频繁，为评估遗传培育效应提供了较为理想的研究样本，且研究现场地处脑卒中高发带[16]，不仅提供了充足的疾病终点事件，更有利于在高危背景下揭示中国人群特异性家庭环境因素(如亲源特异性行为模式)在IS发病中的具体作用路径，对深入理解其遗传与环境病因具有重要价值。(2)受限于样本规模与遗传培育效应分析本身具有探索性质，为减少遗漏潜在的真实信号，本研究在独立SNPs的界定上保留了相对宽松的LD阈值，亦未采用严格的多重检验校正(Bonferroni校正)，因此存在一定的假阳性风险。尽管如此，本研究观测到的遗传培育效应与个体遗传效应方向相反的现象，以及个体遗传效应估计值与既往的研究结果相符[4, 19-20, 35]，均提示本研究结果仍具有较高可靠性。(3)IS作为晚发性疾病，因双亲资料获取困难导致高质量家系样本较为匮乏，是当前开展此类研究的普遍瓶颈[42]。本研究所依托的人群作为现有较大规模的IS家系队列，未来需持续扩大样本规模以不断深化和完善相关研究。
综上所述，本研究在CTNNA基因家族中识别出了16个具有遗传培育效应的IS易感位点，并发现不同亲本来源的遗传培育效应存在异质性，结果提示了遗传培育效应在IS病因中的重要性，为解析复杂疾病中遗传与环境的相互作用提供了新的科学依据。
