膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一。据国际癌症研究机构统计，2022年全球新发病例约为61万余例，位居全球恶性肿瘤发病谱第九位[1]。尽管多数膀胱癌在初诊时仍局限于非肌层浸润阶段(约占70%)，但疾病进展风险不容忽视——约45%的非肌层浸润性膀胱癌可最终演变为肌层浸润性膀胱癌，后者与较差的临床预后密切相关[2-3]。目前，针对以肌层浸润性膀胱癌为代表的进展期膀胱癌，标准治疗策略主要包括根治性膀胱切除术及新辅助化疗，然而此类干预措施不仅伴随较高的治疗风险，亦显著损害患者的远期生活质量[4]。免疫治疗作为一类通过重激活宿主免疫系统以识别并清除肿瘤细胞的新型治疗模式，已为膀胱癌的临床管理带来深刻变革[5]。然而在实际应用中，患者对以免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors，ICI)为代表的免疫疗法应答呈现高度异质性，仅少数个体能够持续临床获益[6]。肿瘤免疫微环境作为决定抗肿瘤免疫应答效能的核心调控因素，其状态与特征对提升膀胱癌免疫治疗整体疗效具有至关重要的意义。
三级淋巴结构(tertiary lymphoid structure，TLS)作为肿瘤微环境中一类具有重要免疫调节功能的异位淋巴样聚集体，在膀胱癌中已被证实与良好预后及治疗反应密切相关，其存在有助于促进免疫效应细胞的局部募集并增强对ICI的应答[7-8]。已有研究表明，膀胱癌微环境中特定的B细胞亚群，如免疫球蛋白λ样多肽5(immunoglobulin lambda like polypeptide 5，IGLL5)阳性B细胞，可通过破坏TLS的结构完整性，削弱机体抗肿瘤免疫应答并降低免疫治疗获益[7]。与之相反，包含功能性生发中心的成熟TLS则与细胞毒性T细胞浸润程度的升高显著关联，从而与更优的临床结局相关[9]。TLS通常于慢性炎症背景(如肿瘤微环境)下原位形成，其有序发育及功能成熟高度依赖于由促炎性细胞因子与趋化因子构成的精密信号网络。上述分子协同介导了淋巴细胞向炎症区域的定向趋化、局部滞留及后续的空间组织化装配。例如，白细胞介素33(interleukin 33，IL-33)可通过激活淋巴毒素(lymphotoxin，LT)-淋巴毒素β受体(LT beta receptor，LTβR)信号轴，驱动TLS在肿瘤组织内的新生与维持[10]。此外，趋化因子CXCL16、CCL19及CCL21等则通过介导淋巴细胞与树突状细胞向炎症病灶的迁移，精确调控TLS内部B细胞区与T细胞区的空间区室化构建[8, 11]。由此可见，在膀胱癌中，TLS的形成与功能发挥受特定细胞因子网络的严谨调控，该调控机制深刻影响着免疫微环境的抗肿瘤效能及ICI治疗的临床响应特性。
CRISPR筛选是一种基于CRISPR-Cas系统的高通量基因功能研究策略，通过在全基因组或特定基因集合范围内系统性地引入基因扰动(包括基因敲除、转录激活或转录抑制)，从而实现基因型与表型之间关联的规模化解析。该技术依赖Cas9或失活的Cas9(dead Cas9, dCas9)与可编程单向导RNA(single-guide RNA，sgRNA)的特异性结合，实现对靶基因的精准调控[12-13]。基于不同类型的文库设计(如全基因组文库或通路特异性文库)，CRISPR筛选可系统地鉴定调控细胞存活、增殖、药物敏感性，以及合成致死相互作用的关键基因[14]。在肿瘤研究领域，CRISPR筛选已被广泛应用于解析肿瘤发生、发展的分子机制，并用于鉴定参与免疫逃逸及药物耐受的关键驱动基因及潜在治疗靶点[14-15]。
本研究基于小鼠全基因组文库，构建了涵盖44种趋化因子的CRISPR激活(CRISPR activation，CRISPRa)文库。依托CRISPR-Cas9系统，在膀胱癌细胞中建立了趋化因子稳定激活的细胞模型。进一步采用正向筛选策略，系统性鉴定参与TLS调控的关键基因，旨在阐明TLS在膀胱癌免疫治疗反应中的调控机制。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
人胚肾细胞HEK293T和小鼠膀胱癌细胞MB49均购自杭州美森细胞生物公司，胎牛血清购自Excell生物公司，高糖DMEM培养基、胰酶、双抗、磷酸盐缓冲液、Opti-MEM培养基均购自美国Gibco公司，嘌呤霉素购自美国MCE公司，杀稻瘟菌素(blasticidin)购自美国赛默飞公司，潮霉素B(hygromycin B)购自酷来博科技公司，线性聚乙烯亚胺(poly-ethylenimine linear，PEI)购自源叶生物公司，实验所需质粒均来自淼灵生物公司，大肠杆菌DH5α感受态细胞购自擎科生物公司，大肠杆菌Endura购自英国LGC公司。
1.2 细胞培养
HEK293T和MB49细胞均用含10%(体积分数)胎牛血清和1%(体积分数)青霉素-链霉素(100×)的高糖DMEM培养基，在37 ℃、5%(体积分数)CO2条件下培养。HEK293T细胞用于慢病毒包装体系包装病毒。用10 cm直径的培养皿培养小鼠膀胱癌细胞系MB49，给MB49加上mCherry标签，使MB49稳定过表达mCherry，便于后续进行活体成像等一系列实验。
1.3 文库质粒构建
44个小鼠趋化因子基因由北京大学定量医学中心实验室筛选，基于张锋教授构建的小鼠全基因组激活文库CRISPR-Cas9的协同激活介导复合体(synergistic activation mediator，SAM)系统以及CRISPRa-v2文库，通过数据库查询、基因注释和文献挖掘，筛选出小鼠的细胞因子基因，sgRNA引物序列由苏州硅基生物公司设计并完成质粒文库的构建。实验设计流程见图 1。
1.4 大肠杆菌质粒转化
1.4.1 电穿孔转化
将大肠杆菌Endura感受态细胞悬液置于冰上10 min，加入约100 ng待转化的文库质粒(氨苄抗性)，在预冷的电转杯中轻柔混匀。电转仪设置参数为：电压1.8 kV，电容10 μF，电阻200 Ω。电击后立即加入预热的培养基，将细胞转移至无菌摇菌管，于37 ℃复苏60 min。取部分复苏菌液涂布于含相应抗生素的LB琼脂平板，将剩余菌液加入含大量抗生素的LB液体培养基中，37 ℃震荡培养12~16 h，用于质粒文库的扩增与收集。
1.4.2 热激转化
将大肠杆菌DH5α感受态细胞悬液置于冰上，加入1~10 ng质粒DNA，轻柔混匀，冰上静置30 min。将离心管置于42 ℃水浴中，精确热激45 s，立即放回冰上，静置2~5 min。再向管中加入800 μL不含抗生素的LB液体培养基，振荡培养12~16 h。
1.5 质粒提取
取出并观察LB固体培养基表面是否有菌落生成。由于文库质粒是一个混合质粒库，因此，需要收集每一个单克隆菌落。向长满单克隆菌落的LB固体培养基中加入5 mL的LB液体培养基，用涂布器将单克隆菌落刮下并转移至新的无菌50 mL离心管中，经反复多次冲刮，至LB液体培养基接近透明为止。将菌液离心，收集细菌沉淀，按照质粒提取试剂盒说明书进行提取，并对提取的质粒进行浓度测定。
1.6 慢病毒包装
HEK293T细胞利用慢病毒包装体系产生病毒。使用10 cm直径细胞培养皿，将15 μg文库质粒、13 μg psPAX2质粒、2 μg pMD2.D质粒与opti-MEM混合，涡旋混匀，加入90 μL PEI，再次涡旋混匀。将混合物加至HEK293T细胞上清中，记录转染时间，再将HEK293T细胞放置在细胞培养箱中，8 h后换液并加入新鲜培养基20 mL。一般在转染48 h时收集第一批含有病毒的培养基，转染72 h时收集第二批含有病毒的培养基，两次共收集含病毒培养基约40 mL，使用40%(体积分数)的聚乙二醇8000(polyethylene glycol 8000，PEG-8000)将收集到的含有病毒的培养基浓缩至原体积的1/10或1/20，将浓缩后的病毒悬液冻存于-80 ℃冰箱。
1.7 细胞病毒感染
待MB49-mCherry细胞贴壁且密度达到60%~80%时，进行慢病毒感染。为后续筛选，需严格控制感染复数(multiplicity of infection，MOI)不超过0.3(此时细胞感染率约为30%)。所需病毒量按公式计算：病毒体积=(MOI×细胞数)/病毒滴度。加入对应量病毒后，按1 ∶ 1 000的比例加入聚凝胺。感染72 h更换培养基，使用嘌呤霉素筛选72 h，保留下来存活的贴壁细胞即为稳定激活小鼠趋化因子基因的膀胱癌细胞系。
1.8 全基因组DNA提取
将106个细胞放至EP管中，加入核糖核酸酶溶液和蛋白酶K室温静置30 min(或在1~20 mg剪碎的小鼠组织中加入蛋白酶K，55 ℃水浴酶解)。将单向导DNA(single-guide DNA，sgDNA)吸附柱置于收集管中，将细胞(或组织)悬液过柱纯化，按照DNA提取试剂盒进行sgDNA提取，提取的sgDNA长期保存于-20 ℃中。
1.9 琼脂糖凝胶电泳
将提取的sgDNA经过高保真DNA聚合酶试剂盒进行扩增，经过初始变性，彻底打开基因组，后经35个循环扩增得到产物。配制浓度为10~20 g/L并含有核酸染料的琼脂糖凝胶，取20 μL PCR产物与上样缓冲液混合后点样。使用DNA分子量标准(DNA marker)作为参照，在150 V电压下电泳15 min。在紫外凝胶成像仪下观察条带，目标条带大小正确、单一明亮。将目标条带进行切胶，DNA纯化，送至诺禾致源生物信息科技有限公司进行测序。
1.10 实时荧光定量逆转录PCR
将细胞置于冰上提取RNA。吸去培养液，每孔加入1 mL Trizol裂解液，用移液枪反复吹打混匀，使Trizol裂解液与细胞混匀，细胞充分裂解。将混悬液移至EP管中待用，用RNA提取试剂盒提取RNA并进行浓度测定，使用逆转录试剂盒进行逆转录得到cDNA，按照实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)反应体系配置反应混合物。
1.11 小鼠腹腔肿瘤造模
本实验选用6~8周龄的C57BL/6雄性小鼠，随机分为对照组和实验组。接种前，用左手抓取并固定小鼠，使其头部稍向下倾斜，腹部向上。在小鼠右下腹腹中线外侧45°进针刺入腹腔，以恒定速率缓慢注入细胞悬液(细胞数为5×106，注射量通常为0.1~0.2 mL)。3周后将小鼠处死，开腹收集腹腔肿瘤，取其中一部分进行sgDNA的提取测序，其余组织泡在40 g/L的多聚甲醛中进行固定，免疫组织化学染色后观察TLS的结构。
1.12 统计学方法
利用GraphPad Prism 10.0软件对实验数据进行统计分析，所有数据结果均为至少3次独立结果的均值±标准差，采用配对t检验或Mann-Whitney非参数检验，P < 0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 成功构建CRISPR-Cas9 sgRNA文库
2.2 CRISPR-Cas9文库感染膀胱癌细胞
采用PCR方法对本研究所用MB49细胞进行支原体污染检测，结果显示，在培养基上清中未扩增出特异性的支原体基因片段，提示该细胞系未受支原体污染，可用于后续实验(图 3)。随后，对辅助质粒dCas9进行扩增并包装为慢病毒，用于感染MB49-mCherry细胞。经抗生素筛选去除未成功感染的细胞，并通过实时荧光定量逆转录PCR实验评估病毒转染及转录激活效率，转染dCas9病毒组的细胞转染效率大概为对照组(未转染dCAS病毒，初始值接近于0)的400倍(图 4A)。进一步地，利用流式细胞分选技术将MB49-mCherry细胞进行单细胞分选至96孔板中，确保每孔仅含单个细胞，并进行克隆扩增。扩增完成后，采用PCR方法筛选获得稳定表达辅助病毒的阳性单克隆细胞株，用于后续实验(图 4B)。
为保证每个细胞仅整合单一sgRNA，从而实现单基因过表达并维持约500倍的文库覆盖度，在慢病毒感染过程中严格控制MOI不超过0.3。感染持续72 h后，利用载体质粒所携带的嘌呤霉素抗性基因进行药物筛选，去除未被有效转导的细胞。经过约2周筛选，获得稳定表达且具有嘌呤霉素抗性的膀胱癌细胞系MB49-mCherry。
2.3 小鼠体内筛选
将转染含132条sgRNA慢病毒文库且文库覆盖度≥500倍的MB49-mCherry细胞作为实验组，同时设置对照组(未转染sgRNA文库，仅感染空载体病毒)，分别进行体外扩增。随后，将各组细胞接种于小鼠体内，每只小鼠接种5×106个细胞，每组有4只小鼠，建立腹腔肿瘤模型以开展体内CRISPR筛选。接种3周后处死小鼠，剥离并收集肿瘤组织(图 5)。
图5 CRISPR筛选小鼠腹腔肿瘤结果Figure 5 Results of CRISPR screening for peritoneal tumors in mice A, gross view of mice and tumor measurement; B, gross anatomy of the peritoneal cavity in the control group (arrow indicates tumor location); C, gross anatomy of the peritoneal cavity in the experimental group (arrows indicate tumor locations). |
图6 对照组与实验组CD20染色结果Figure 6 CD20 staining results between the control group and the experimental group |
图7 对照组与实验组CD3染色结果Figure 7 CD3 staining results between the control group and the experimental group |
图8 对照组与实验组TLS形成数量对比Figure 8 Comparison of the number of TLS formed between the control group and the experimental group TLS, tertiary lymphoid structure. |
免疫组织化学结果显示，实验组与对照组的TLS均主要分布于肿瘤边缘区域，其空间定位未见显著差异。鉴于TLS成熟度的评估通常依赖CD23等滤泡树突状细胞相关标志物的染色结果作为重要判定依据，而本研究尚未进行CD23染色，因此，目前无法对两组间TLS成熟程度的差异作出明确判断。值得注意的是，实验组中TLS的数量较对照组呈增加趋势(图 8)。
对高通量测序数据进行分析后，筛选出在肿瘤组织中sgDNA丰度有变化的趋化因子。结果显示，与初始文库相比，Cx3cl1和Ccl20对应sgDNA的丰度降低，而Cxcl16的sgDNA丰度显著升高(P＜0.05，图 8)。需要指出的是，本研究采用的是包含44种趋化因子的混合文库筛选策略，因此上述候选分子在TLS形成中的具体功能仍需通过单基因层面的独立验证进一步加以确认，以明确其在TLS发生和发展中的作用。
2.4 筛选出影响TLS形成的趋化因子
对CRISPR筛选获得的候选趋化因子在小鼠体内进行单独功能验证。采用腹腔注射方式，分别给予各实验组小鼠趋化因子CX3CL1、CCL20和CXCL16处理。处理3周后处死小鼠，剥离肿瘤组织并进行固定，随后开展CD20和CD3的免疫组织化学染色，以评估TLS的形成情况。结果显示，在所验证的候选分子中，CX3CL1对膀胱癌组织中TLS具有显著调控作用(图 10)。与对照相比，CX3CL1处理组肿瘤组织中CD20+ B细胞及CD3+ T细胞的聚集程度明显降低，且TLS结构完整性受损，提示CX3CL1可能在TLS的形成或维持过程中发挥抑制作用。
3 讨论
小鼠全基因组基因筛选成本高昂，且基因覆盖率和均一性难以完全保证，容易导致筛选失败或数据偏差。本文对筛选文库进行了优化，选用了细胞因子这一小子库进行筛选，每个基因设计3条sgRNA，可在一定程度上控制脱靶效应，提高筛选结果的可信度与可重复性[16]。同时，这一策略也有助于缩短实验周期，简化后续数据分析，并在一定程度上降低实验成本。CRISPR筛选作为一种适用于表型研究的高通量手段，在肿瘤驱动基因、抑癌基因及免疫治疗耐药相关分子的发现中具有重要价值。基于此，本文利用CRISPR-Cas9系统对可能调控膀胱癌中TLS形成的相关细胞因子进行了筛选，并对筛选得到的差异趋化因子逐一开展动物实验验证。结果显示，Cx3cl1处理后小鼠肿瘤组织中CD20+B细胞和CD3+T细胞聚集减少，提示CX3CL1可能参与膀胱癌中TLS相关结构的调控。这一现象提示，CX3CL1在膀胱癌免疫微环境中的作用可能并非单纯促进免疫细胞募集，而更可能参与TLS形成、维持及空间组织化过程的调节。
CX3CL1作为一种多效性趋化因子，通过与其特异性受体CX3CR1结合，在肿瘤免疫微环境中发挥了复杂的调控作用。CX3CL1-CX3CR1轴具有显著的“双刃剑”特征。在促肿瘤方面，CX3CL1-CX3CR1轴在胶质母细胞瘤中可招募肿瘤相关巨噬细胞并诱导其向M2样免疫抑制表型极化，进而促进免疫逃逸与血管生成[17]。此外，其高表达也与高分级浆液性卵巢癌患者生存率下降[18]，以及口腔鳞状细胞癌转移风险升高和总生存率降低密切相关[19]。然而，在抗肿瘤方面，乳腺癌模型中的CX3CL1过表达能够有效趋化自然杀伤细胞等抗肿瘤效应淋巴细胞，显著抑制肿瘤生长与肺转移，并可与曲妥珠单抗协同增强细胞毒性，克服人类表皮生长因子受体-2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)低表达肿瘤的耐药性[20]。这种双重作用使其成为预后评估和联合免疫治疗[如与程序性死亡受体-1(programmed cell death protein 1，PD-1)抑制剂联用]的重要潜在靶标。在尿路上皮癌中，既往研究揭示CX3CL1基因的功能缺失性改变伴随免疫炎症通路的下调，并与ICI治疗应答不佳及生存期缩短显著相关[21]。目前关于CX3CL1-CX3CR1轴在TLS形成与功能调控中的研究仍十分有限。现有证据表明，CX3CL1可通过稳定原发性干燥综合征患者唾液腺内滤泡树突状细胞与B细胞的相互作用，增强生发中心反应并促进原位自身抗体的产生[22]。然而，CX3CL1-CX3CR1轴在膀胱癌免疫微环境中的具体作用尚不明确，特别是其对膀胱癌组织中TLS形成及功能的影响迄今未见报道。鉴于该轴在多种病理条件下所展现的“双刃剑”效应，其在膀胱癌中的确切角色仍有待进一步阐明与分析。
此外，本研究还存在若干不足。首先，本研究尚未对CX3CL1在膀胱癌组织中的表达情况及其具体来源细胞进行系统性分析。既往研究表明，CX3CL1在生理及炎症条件下主要由血管内皮细胞表达，并在免疫细胞募集与黏附过程中发挥重要作用[23]。因此，本研究基于CRISPR筛选体系在肿瘤细胞中获得的CX3CL1相关结果，可能与其在真实肿瘤微环境中的表达模式存在差异，尤其是在本研究所采用的CRISPR激活模型中，趋化因子主要来源于肿瘤细胞，这一人为干预状态在一定程度上偏离了体内生理条件，可能影响结果的外推性。其次，本研究对TLS的界定尚不够严格，主要依据CD20和CD3免疫组织化学染色观察淋巴细胞聚集情况，若要进一步评估TLS的成熟度及功能状态，则需引入额外标志物——如滤泡树突状细胞标志物CD21、生发中心标志物CD23等，以提供与成熟度和功能相关的关键细节。这亦是本研究的重要局限之一。再次，本研究采用腹腔肿瘤模型进行验证，虽然能够在体内环境下观察肿瘤与免疫微环境的相互作用，但与膀胱癌原位肿瘤微环境之间仍存在一定差异，这可能对部分结论的适用范围产生一定影响。然而，就现阶段的技术手段而言，小鼠膀胱癌原位模型主要通过膀胱灌注或开腹膀胱壁注射两种方法构建，但这两种方式均存在成瘤率低、重复性差的突出问题，且目前尚无可供广泛推广的稳定原位造模方案。正是基于这一技术瓶颈，本研究在权衡可行性与生理相关性后，选择了更为成熟且可重复的腹腔模型作为替代性体内验证手段。此外，本文主要针对单个候选基因进行初步验证，尚未系统阐明CX3CL1影响TLS相关结构变化的具体分子机制。最后，研究结论尚缺乏大样本临床队列的双向验证，筛选结果与真实世界临床特征之间的一致性仍需谨慎评估。
综上，本研究初步提示CX3CL1可能参与膀胱癌TLS相关免疫结构的调控，为理解膀胱癌肿瘤免疫微环境提供了新的线索。然而，CX3CL1在膀胱癌中的表达特征、作用方向及其分子机制，尤其是其与成熟TLS形成之间的关系，仍有待进一步阐明。未来研究应结合临床组织样本，并采用多重免疫组织化学、单细胞测序、空间转录组学及功能干预实验，对TLS的组成、成熟度和空间分布进行更严格的界定，从而为膀胱癌免疫治疗潜在靶点的发现和精准干预策略的建立提供更可靠的实验依据。
