北京大学学报（医学版） ›› 2009, Vol. 41 ›› Issue (6): 613-619.
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郑宗方1,2, 韩巍3, 何其华4, 柯杨1,2,3,杜晓娟2,3△
摘要：
目的：制备抗KIAA0649多克隆抗体并鉴定抗体的特异性，同时初步鉴定KIAA0649蛋白在细胞内的定位及其功能结构域。方法：通过TMHMM和DNAstar等软件对KIAA0649的蛋白质序列进行分析，选取了3段序列合成多肽，将3段多肽混合后对新西兰兔进行免疫，通过酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immuno-sorbnent assay, ELISA)测定血清中抗多肽的滴度，当抗血清的滴度达到1∶105（体积比）时取血清，通过免疫亲和层析柱对抗体进行纯化。在U2OS细胞中表达Flag-KIAA0649或通过小干扰RNA沉默内源的KIAA0649，提取细胞蛋白，电泳后转膜，通过Western blot分析上述制备的多克隆抗体的特异性；将表达Flag-KIAA0649的细胞在玻片上固定，用抗Flag抗体和抗KIAA0649抗体进行双色免疫荧光分析，通过免疫荧光对KIAA0649抗体进行鉴定。利用PCR克隆构建Flag-KIAA0649全长表达质粒和系列Flag-KIAA0649缺失突变体，转染细胞后通过免疫荧光对KIAA0649在细胞内的定位进行研究。 结果：得到的纯化KIAA0649多克隆抗体特异性地识别内源及外源KIAA0649蛋白，可用于免疫荧光和Western blot分析；全长KIAA0649蛋白在细胞核内显示特定的分布方式；KIAA0649的缺失突变体中，含有PENF motif 的突变体与全长KIAA0649蛋白在细胞核内的分布形式一致，推测该结构域可能为KIAA0649 的功能结构域。 结论：通过上述方法制备的KIAA0649 多克隆抗体具有较高的特异性，可应用于KIAA0649的功能研究，KIAA0649在细胞内定位的研究对于阐明KIAA0649的功能机制具有重要意义。
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