溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种全身性免疫反应性疾病，UC患者可同时存在多种肠外表现，口腔是其最常受累的肠外器官之一[1]。近年来，发展中国家的UC患病率逐年升高，且治疗手段有限，极大加重社会、经济以及医疗系统负担[2]。目前，UC的发病机制尚未完全明确，以往研究提示可能是肠道免疫调节失衡，炎症细胞被激活所致[3]。对UC的诊断尚缺乏金标准，主要依赖于肠镜及病理活检，现阶段缺乏非侵入性、快捷有效、具有特异性的方法来辅助诊断UC[4]。外泌体是一种直径为40~150 nm的微囊泡，其内可包含蛋白质、脂质、核酸等。外泌体拥有稳定的膜结构，可向远处传播并且不破裂，具有运输物质的能力，是远距离器官之间物质沟通的主要参与者[5-7]。开发外泌体内容物作为疾病诊断生物标志物并研究其在器官沟通之间发挥的功能具有重要意义。本研究使用shotgun质谱技术对初诊初治UC活动期患者以及健康对照(healthy control, HC)组志愿者唾液外泌体内蛋白质进行分析，旨在提供无创的特异性生物标志物来辅助诊断UC，然后通过对UC患者及健康对照组志愿者唾液外泌体内差异蛋白进行GO/KEGG(gene ontology/Kyoto encyclopedia of genes and genomes)分析，以及在体外将两组唾液外泌体分别于巨噬细胞共培养，从而探索UC患者唾液外泌体内特异性高表达的蛋白质在其发病过程中可能发挥的作用。
1 资料与方法
1.1 临床资料及样本收集
北京大学人民医院消化内科2021年7月至2022年6月共招募初诊未经过治疗的UC活动期患者37例，男22例，女15例；年龄18~67岁，平均(39.1±13.9)岁。患者诊断基于临床表现、影像学、内镜检查结果，并排除肿瘤、其他自身免疫病等已知可能影响唾液外泌体检测的系统性疾病，同时进行口腔检查排除龋、牙周炎等口腔疾病。招募健康对照组志愿者10人，男6例，女4例；年龄24~55岁，平均(37.7±13.7)岁，排除肿瘤、自身免疫性疾病等已知可能影响唾液外泌体检测的系统性疾病，并且排除龋、牙周炎等口腔疾病，两组的一般临床资料比较差异无统计学意义。所有患者与志愿者均取唾液样本，受试者在唾液收集前休息15 min，放松状态下坐在一个安静的房间里，要求其将舌尖顶住上颚，头自然低垂，收集自然流出的唾液于50 mL离心管中，要求收集5 mL左右。收集过程中，受试者禁止说话。收集后，立即将未刺激的整个唾液样本置于冰上保存，然后在4 ℃下以10 000g离心10 min，以除去食物残渣以及细胞碎片，上清液暂存于4 ℃冰箱，用于后续唾液外泌体的提取。本研究开始前已经北京大学人民医院伦理委员会审查批准(2020PHB112)，所有研究对象包括患者和健康对照组志愿者均签署知情同意书。
1.2 唾液外泌体的提取及鉴定
根据Invitrogen Total Exosome Isolation试剂盒(Invitrogen，美国)说明书进行外泌体提取，使用透射电镜来确定提取外泌体的形状，并确认外泌体的分离。将提取的外泌体重悬于PBS中，然后外泌体样品被等份(5 μL)放置在碳涂层网格上(先用等离子清洁剂处理，Ted Pella Inc, 美国)，30 s后用滤纸吸干样品，再用2%(质量分数)醋酸铀酰染色1 min，在FEI T12电子显微镜120 kV下检查网格。显微照片使用Gatanultra扫描4K×4K拍摄。运用Zetasizer Nano测量唾液外泌体粒径(dynamic light scattering，DLS)及表面zeta电位。
1.3 Shotgun质谱分析
将混合后的37例UC活动期患者唾液外泌体分为3份，混合后的10名健康对照志愿者唾液外泌体也分为3份，分别进行Shotgun质谱分析。首先通过10% (体积分数)SDS-PAGE分离外泌体蛋白质，并将样品凝胶泳道切成5~6片。然后将胶条置于包含了50 mmol/L(NH4)2CO3的胰蛋白酶水解液中酶解过夜后，酶解液经萃取、真空干燥、复溶、高速离心等步骤制成可用于LC-MS/MS分析的多肽溶液。使用美国Thermo公司的UltiMate 3000 RSLCnano液相色谱串联LTQ Orbitrap Velos Pro质谱仪进行多肽的色谱分离与质谱鉴定，经过Proteome Discoverer软件处理获得蛋白质的鉴定结果与丰度。选择各组3份样本中均表达的蛋白质进行组间分析。
1.4 唾液外泌体与佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA)诱导的人源单核细胞系(human monocyte leukemia cells，THP-1)细胞共培养模型
THP-1购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心，THP-1为悬浮细胞，参考ATCC细胞培养说明书完成细胞复苏、培养、传代及冻存培养。将10 mL胎牛血清(Gibco，美国)1 mL青/链霉素双抗(Gibco，美国)加入89 mL RPMI 1640培养液(Gibco，美国)中，配置RPMI 1640完全培养液，混匀后保存于4 ℃冰箱。使用完全培养液将THP-1细胞密度调整为5×104/mL，移入12孔板(1 mL/孔)。在孔板中加入PMA(Biolegend，美国)，终(质量)浓度为100 μg/L，混匀后置于细胞培养箱中培养24 h，然后在光镜下观察细胞，悬浮细胞诱导为贴壁细胞，呈现多形性，即为THP-1源巨噬细胞诱导成功。换液后使用不加血清的RPMI 1640培养基，在孔板中分别加入来源于UC活动期患者或健康对照唾液来源的外泌体，终(质量)浓度为40 mg/L，混匀后置于细胞培养箱中培养24 h。
1.5 ELISA检测培养上清IL-6、TNF-α、IL-1β水平
分离细胞培养上清，使用ELISA试剂盒(联科生物技术股份有限公司，杭州)测定细胞上清液中IL-6、TNF-α、IL-1β的水平，按照试剂盒说明书进行操作，计算出对应的IL-6、TNF-α、IL-1β浓度。
1.6 实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative PCR，qPCR)检测CD80+和CD86+
使用Trizol法提取细胞RNA(Invitrogen，美国)，使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit逆转录试剂盒，逆转录RNA为cDNA，实验过程按照试剂盒说明书完成。使用Power SYBR@Green PCR Master MIX试剂盒(Applied Biosystems，美国)，以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR扩增，每个样本同一种引物做2个复孔，同时检测溶解曲线，至少进行3次独立实验。引物由生工生物工程(上海)有限公司设计并合成，引物序列见表 1。
表1 实时定量聚合酶链反应扩增所用的基因引物序列Table 1 The sequences of target genes' primers used in qPCR amplification |
| Gene | Forward (5′-3′) | Reverse (5′-3′) |
| CD86+ | CTGCTCATCTATACACGGTTACC | GGAAACGTCGTACAGTTCTGTG |
| CD80+ | GGCCCGAGTACAAGAACCG | TCGTATGTGCCCTCGTCAGAT |
| GAPDH | GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT | GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG |
qPCR, real-time quantitative PCR; GAPDH, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. |
1.7 统计学分析
蛋白组学数据使用Proteome Discoverer内置的Sequest算法，数据库下载自uniprot网站(https://www.uniprot.org)，人的数据库编号为UniProtKB (UP000005640)，包含80 581个蛋白质，更新日期为2022年10月18日。使用内置选项在SwissProt数据库中对数据进行搜索找到对应基因名称。使用DAVID网站(https://david.ncifcrf.gov/)进行GO分析，基于KEGG进行通路分析，Cytoscape软件、clusterProfiler、pathview R包进行数据整合统计及信号通路的可视化[8-9]。
实验结果采用Graphpad Prism 8.0和SPSS 23.0软件进行作图及统计学分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用One Way ANOVA，进一步两两比较采用LDS法，不符合正态分布的数据采用非参数检验，双侧检验，P＜0.05认为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 唾液外泌体验证
2.2 健康对照组志愿者与溃疡性结肠炎患者中的唾液外泌体蛋白质差异分析
图2 UC组与HC组唾液外泌体蛋白质种类对比Figure 2 Comparison of salivary exosomal proteins between the ulcerative colitis (UC) group and the healthy control (HC) group |
表2 UC组与健康对照组唾液外泌体差异表达的15种蛋白质Table 2 15 differential proteins in salivary exosomes between the UC group and the healthy group |
| Protein ID | Gene | Description | Fuction |
| Up regulated (11) | |||
| P13667 | PDIA4 | Protein disulfide-isomerase A4 | Protein processing in endoplasmic reticulum |
| P01023 | A2M | Alpha-2-macroglobulin | Complement and coagulation cascades |
| P13639 | EEF2 | Elongation factor 2 | Neutrophil degranulation |
| P01024 | C3 | Complement C3 | Complement and coagulation cascades |
| P25787 | PSMA2 | Proteasome subunit alpha type-2 | Proteasome actvities |
| P28072 | PSMB6 | Proteasome subunit beta type-6 | Proteasome activities |
| P25786 | PSMA1 | Proteasome subunit alpha type-1 | Proteasome activities |
| P01857 | IGHG1 | Ig gamma-1 chain C region | Immunoglobulin receptor binding |
| P01860 | IGHG3 | lg gamma-3 chain C region | Immunoglobulin receptor binding |
| P01861 | IGHG4 | Ig gamma-4 chain C region | Immunoglobulin receptor binding |
| B4E1H2 | SERPING1 | Plasma protease C1 inhibitor | Complement and coagulation cascades |
| Down regulated (4) | |||
| P20061 | TCN1 | Transcobalamin-1 | Vitamin binding |
| P03973 | SLPI | Antileukoproteinase | Endopeptidase regulator activity |
| Q9UBR2 | CTSZ | Cathepsin Z | Endopeptidase activity |
| Q07654 | TFF3 | Trefoil factor 3 | Regulation of small molecule metabolic process |
2.3 HC组与UC组唾液外泌体差异蛋白对应基因的GO/KEGG富集分析
运用GO对UC患者与健康对照中差异表达的213种蛋白质(69+129+15)对应的基因进行分析。这些差异蛋白对应基因可富集在多种GO功能上，选取显著差异的靶基因进行注释(P＜0.05)，在图 3中展示最为显著的前十项。在生物过程中主要富集于多种免疫反应上，包括体液免疫反应以及中性粒细胞激活相关的免疫反应等；在细胞组分方面主要集中在蛋白酶体结构以及微囊泡中。
在分子功能中主要与内肽酶活性等相关。对差异基因进一步进行KEGG富集分析，选取显著差异的信号通路进行注释(P＜0.05)，在图 4中展示最为显著的前十项。显示其主要富集在补体级联通路、蛋白酶体，以及系统性红斑狼疮、阿尔兹海默症、帕金森病等系统性疾病中。UC患者对比健康对照志愿者唾液外泌体差异蛋白主要富集在蛋白酶体中，另外PA28a的表达上调可促进免疫型蛋白酶体的合成。除蛋白酶体外，发现UC唾液外泌体中补体级联通路中C1复合物，C3，C5和C6~9表达上调，揭示唾液外泌体中补体蛋白可能与UC之间存在关联。结果分析表明UC组患者口腔唾液外泌体内容物表达与HC组不同，许多特异性表达的蛋白质相关基因均与炎症反应和免疫反应相关。
2.4 活动期UC患者唾液外泌体促进巨噬细胞(THP-1)向M1型极化
活动期UC患者的唾液外泌体携带与免疫及炎症反应相关的特异性蛋白质。UC作为一种自身免疫性疾病，结肠的免疫中心即结肠固有层内免疫细胞的过度炎症是其发病的直接细胞学病因，巨噬细胞在固有层炎症调节中发挥重要作用。为明确唾液外泌体对巨噬细胞的作用，在体外，本课题组建立了细胞模型(图 5A)：用100 ng/L PMA诱导THP-1 24 h, 使其分化为巨噬细胞后, 将40 mg/L来源于UC活动期患者或健康对照组志愿者唾液来源的外泌体分别与THP-1细胞同培养24 h，无外泌体刺激组为空白对照组。用ELISA检测细胞培养液中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量, 通过qPCR检测M1型巨噬细胞表面标志物CD80+和CD86+。与健康对照组相比，活动期UC患者唾液外泌体可以通过促进巨噬细胞向M1型转化并分泌炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α，从而发挥促炎的作用(图 5B、C)。
图5 唾液外泌体在体外对巨噬细胞的作用Figure 5 Effect of salivary exosomes on THP-1 cells in vitro A, co-culture model diagram of human monocyte leukemia cells (THP-1) cells and salivary exosomes; B, expression of inflammatory cytokines in cell culture supernatant detected by ELISA; C, mRNA expression profile of surface markers in M1 macrophages. Control, blank group without exosome stimulation; HC, healthy control; UC/A, active UC patients; SE, salivary exosomes. Data are $\bar x \pm s$, # P < 0.01, *P < 0.001. |
3 讨论
目前，唾液外泌体已被证实与口腔疾病，如口腔癌、牙周炎、口腔扁平苔藓等有关，还同远处部位肿瘤(如胰腺癌、肺癌等)和系统性疾病(如帕金森病等)相关，在临床诊疗方面有重要意义[11-13]。UC的诊断主要依赖于肠镜检查，部分血清学指标(如粪便钙卫蛋白、C反应蛋白等)可用于辅助诊断，但其缺乏特异性[14]。另有研究表明炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)患者血清外泌体内妊娠带蛋白明显升高，可用于辅助诊断[15]。不同来源的外泌体功能差异巨大，相较于其他体液，唾液具有无创、易于收集、患者依从性高等显著优势。本研究通过对比UC患者与健康人群唾液外泌体蛋白质，发现UC的发生发展会改变唾液外泌体内蛋白质的表达，在两组共表达的蛋白质中有15种蛋白质表达量存在明显差异，研究提示UC患者唾液外泌体内特异性高表达的蛋白质有作为辅助UC诊断的潜力，但是这些差异蛋白尚需在更多UC患者中进行验证，以明确研究发现的唾液外泌体内差异蛋白组合对辅助诊断UC的准确性。
本研究通过对UC患者与健康人群唾液外泌体差异蛋白进行功能分析，发现UC组唾液外泌体内蛋白酶体相关蛋白PSMA1、PSMA2、PSMB6表达升高。蛋白酶体可参与多种细胞内重要的生物学过程，如炎症反应、免疫应答, 以及氧化应激等，是维持细胞乃至整个机体正常运行的重要功能单位[16]。Cleynen等[17]发现侵袭性大肠杆菌可以通过调节泛素-蛋白酶体系统启动并增加蛋白酶体活性从而加重IBD。除此之外，本课题组还注意到UC组唾液外泌体蛋白质中PA28a升高，其可促进免疫型蛋白酶体的形成。免疫型蛋白酶体被证明与免疫系统之间有着错综复杂的关系，其可参与包括抗原提呈、细胞信号转导、免疫炎症反应等过程。近期的多项研究表明免疫蛋白酶体的亚单位在许多自身免疫性疾病(如干燥综合征、多发性硬化症等)患者血清或者动物模型中表达增加[18]。另有研究发现在动物模型中应用免疫蛋白酶体抑制剂可减轻自身免疫性疾病的炎症反应，有望成为多种自身免疫性疾病治疗的新靶点[19]。另外，本研究观察到UC组唾液外泌体中补体级联通路中多种关键分子(如C3等)表达上调。补体系统是机体免疫防御的重要组成部分，对维护机体内环境的平衡具有重要作用[20]。Wong等[21]从结肠炎小鼠血清中分离的外泌体蛋白质进行分析，鉴定了56个高表达蛋白质，其中大多主要参与补体和凝血级联通路。补体系统的过度活化可产生多种活性片段，这些活性片段可诱导炎症反应。Halstensen等[22]发现UC和CD患者结肠黏膜肌层和黏膜下血管中存在末端补体复合物的沉积。
UC患者存在口腔内环境紊乱，UC患者的口腔病损可在某种程度上反映其肠道炎症的情况[1]。人体每天产生并吞咽约1.5 L的唾液，有研究表明将UC患者唾液给予小鼠灌胃可以加重小鼠肠道炎症，提示口腔可能以唾液为媒介参与了UC发病[23]。外泌体具有稳定、远距离传播并不破裂的特性[5]。唾液外泌体可能随着唾液吞咽源源不断地到达肠道，从而对肠道产生持续性刺激。Mitsuhashi等[24]通过对比IBD患者肠液与健康人肠液的外泌体，发现两者内载mRNA和蛋白质谱具有明显的差异，IBD患者肠液来源的外泌体可被上皮细胞和巨噬细胞吞噬，促进上皮细胞炎症反应并诱导巨噬细胞迁移，加重肠道炎症及促进炎症扩散。然而, 唾液外泌体在疾病发生发展中的作用研究仍处于早期阶段，本研究发现来源于UC活动期患者的唾液外泌体携带与免疫及炎症相关的特异性蛋白，然后通过在体外将UC活动期患者与健康对照组志愿者唾液来源的外泌体分别与巨噬细胞共培养，发现活动期UC患者唾液外泌体可以促进巨噬细胞向M1型转化并分泌促炎因子，以上提示UC患者唾液外泌体可能参与口腔与肠道的沟通，并可能在UC的发生发展中发挥作用。
本研究存在一定局限性，首先患者的样本量较少，不足以全面验证唾液外泌体内差异蛋白组合辅助诊断UC的特异性；其次，未能进一步细化分组，分析活动期UC患者与缓解期UC患者唾液外泌体内的差异蛋白。
未来，本课题组将在更大样本量群体中验证UC患者与健康对照唾液外泌体内的差异蛋白，从而评估唾液外泌体内差异蛋白组合辅助诊断UC的特异性。下一步研究可通过体外构建表达特异性目标蛋白的外泌体，从而深入挖掘唾液外泌体内影响肠道炎症的关键因子，为开发精准治疗UC的方法奠定基础。
综上所述，UC患者唾液外泌体内高表达的蛋白包括蛋白酶体以及补体级联通路相关蛋白，与机体炎症以及免疫反应相关，活动期UC患者唾液外泌体可以促进巨噬细胞向M1型转化，从而促进肠道炎症。
