特发性炎性肌病(idiopathic inflammatory myopathy，IIM)是一组获得性免疫介导的肌肉疾病，其发病率为每百万人1~10例[1-2]。IIM主要表现为急性或亚急性发作的近端肌无力和肌痛，常伴有血清肌酸激酶的升高，并可累及肺、心脏等其他器官。根据不同的临床表现和自身抗体，IIM可分为皮肌炎(dermatomyositis，DM)、多发性肌炎(polymyositis，PM)、免疫介导的坏死性肌病(immune-mediated necrotizing myopathy，IMNM)和重叠性肌炎(overlap syndrome，OM)等不同亚型[3]。至今，IIM的发病机制尚不明确，目前的观点认为其是遗传因素、环境因素、免疫机制和非免疫机制等多种因素相互作用的结果[4]。
细胞焦亡是一种细胞程序性死亡形式，被认为是IIM中固有免疫异常活化的重要机制之一。细胞焦亡的核心是炎症小体，由模式识别受体(pattern-recognition receptor，PRR)、衔接蛋白细胞凋亡相关斑点蛋白(apoptosis-associated speck-like protein，ASC)以及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(cysteine aspartate-specific protease-1, caspase-1)三部分组成。黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2，AIM2)属于PYHIN蛋白家族，在单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞中表达，参与炎症反应并调节细胞焦亡，是细胞内唯一能够识别细胞质双链DNA(double-stranded DNA，dsDNA)的炎症小体[5]。目前研究发现，AIM2参与多种自身免疫性疾病的发病过程，如系统性红斑狼疮[6]、类风湿性关节炎[7]和干燥综合征[8]，但对于AIM2在IIM中作用的研究相对较少[9]。本研究旨在通过检测外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中AIM2、caspase-1、焦孔素蛋白D(gasdermin D，GSDMD)、白细胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)和IL-18的mRNA和蛋白表达水平，并分析血清中IL-1β和IL-18的表达水平，以探讨AIM2炎症小体介导的细胞焦亡途径在IIM发病机制中的作用。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择2020年5月至2022年6月在中国人民解放军北部战区总医院风湿免疫科住院的30例IIM患者(IIM组)，以及同期在本院体检中心进行体检且与IIM组患者在性别和年龄上匹配的30名健康志愿者(健康对照组)。
纳入标准：(1)诊断标准：PM、DM诊断依据2017年欧洲抗风湿病联盟(European League Against Rheumatism，EULAR)/美国风湿病学会(American College of Rheumatology，ACR)标准中的IIM诊断标准[4]，IMNM诊断依据2017年欧洲神经肌肉疾病中心工作组224届会议提出的诊断标准[10]，OM诊断依据Selva-O’Callaghan A的分类标准[3]；(2)患者均神志清楚，无智力障碍，能够理解研究内容并配合研究者。排除标准：(1)合并各种急慢性感染、甲状腺功能减退等内分泌代谢性疾病、原发性胆汁性肝硬化、重症肌无力；(2)由药物、电解质紊乱或剧烈运动等引起的横纹肌溶解；(3)恶性肿瘤相关性肌炎；(4)资料不完整。
收集患者的血常规、C反应蛋白、红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)、肝功能、心肌酶谱等相关实验室指标，并根据患者的临床表现、疼痛严重程度、受累部位等对其进行评分。本研究已获得北部战区总医院医学伦理委员会审批[伦审Y(2022)133号]，所有患者均签署知情同意书。
1.2 试剂和材料
主要试剂包括：Quant-iTTM PicoGreen® dsDNA检测试剂盒(美国Invitrogen)、PrimeScriptTM RT Master Mix试剂盒(日本TaKaRa)、TB Green® Premix Ex TaqTM试剂盒(日本TaKaRa)、外周血RNA提取试剂盒(日本TaKaRa)、雅酶一步法PAGE凝胶快速制备试剂盒(上海雅酶)、IL-1β和IL-18酶联免疫吸附检测(enzyme-linked immuno-sorbent assay，ELISA)试剂盒(MM-0139H1，MM-0181H1，江苏酶免)。
依据GeneBank中GAPDH、AIM2、caspase-1、GSDMD、IL-1β和IL-18基因序列设计引物，用于实时定量逆转录PCR检测。PCR引物由上海生工公司合成，各引物序列见表 1。
表1 AIM2炎症小体通路基因引物序列Table 1 The primer sequences for AIM2 inflammasome pathway genes |
| Gene | Forward primer | Reverse primer |
| GAPDH | 5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′ | 5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′ |
| AIM2 | 5′-AGCAAGATATTATCGGCACAGTG-3′ | 5′-GTTCAGCGGGACATTAACCTT-3′ |
| caspase-1 | 5′-TTTCCGCAAGGTTCGATTTTCA-3′ | 5′-GGCATCTGCGCTCTACCATC-3′ |
| GSDMD | 5′-GTGTGTCAACCTGTCTATCAAGG-3′ | 5′-CATGGCATCGTAGAAGTGGAAG-3′ |
| IL-1β | 5′-TGAGCTCGCCAGTGAAATGAT-3′ | 5′-TGCTGTAGTGGTGGTCGGAG-3′ |
| IL-18 | 5′-TTCAAGACCAGCCTGACCAAC-3′ | 5′-GCTCACCACAACCTCTACCTCC-3′ |
GAPDH, glyceraldehyde-3-phosphate dyhydrogenase; AIM2, absent in melanoma 2; caspase-1, cysteine aspartate-specific protease-1; GSDMD, gasdermin D; IL-1β, interleukin 1β; IL-18, interleukin 18. |
蛋白免疫印迹所用抗体：anti-GSDMD兔多克隆抗体(P57764，Bioss)、anti-caspase-1兔单克隆抗体(#3866，Cst)、anti-AIM2兔多克隆抗体(abs125828，Absin)、anti-IL-1β兔单克隆抗体(#12703，Cst)、anti-IL-18兔单克隆抗体(#54943，Cst)、anti-GAPDH兔单克隆抗体(GB15004，Servicebio)。
1.3 疾病严重程度和活动度评估
(1) 视觉模拟评分(visual analog scale，VAS)量表：用于评价疼痛程度，0分为无痛，1~3分为轻度疼痛，4~6分为中度疼痛，7~10分为重度疼痛[11]。(2)肌力检查(manual muscle testing，MMT)：用于评估肌炎活动性和损害，徒手测量多部位肌力，总分0~80分，通常检测优势肌肉[11]。(3)肌炎疾病活动度评估工具(myositis disease activity assessment tool，MDAAT)：用于评估肌肉外受累器官，涉及一般情况、皮肤黏膜、骨骼关节等8个项目[12-13]。(4)肌炎疾病活动度评估视觉模拟量表(myositis disease activity assessment visual analogue scale，MYOACT)评分：包括7方面, 含一般情况、皮肤黏膜、骨关节、胃肠道、肺、心血管、肌肉, 由26个项目组成; 由风湿免疫科医师结合临床症状、体征或实验室结果，用VAS量表标记每个项目总活动性[12, 14]。(5)肌炎损伤指数(myositis damage index，MDI)：用于评估肌炎患者因疾病或治疗导致的永久性或持续性损伤，由医生对患者的9个器官系统的损伤程度进行评分，包括损伤的严重程度和范围，成人为0~38分，总分越高表示损伤越严重[11-12, 14]。
1.4 荧光定量法检测血清中的dsDNA
将待测血清样本置于冰上缓慢解冻。从-20 ℃冰箱中取出染色试剂(Reagent A)在冰上解冻，准备1 mL的稀释液(Reagent B)加入1.5 mL的EP管中，加入5 μL染色试剂，轻轻混匀后避光保存，标记为染色反应液。用1×TE缓冲液将100 mg/L的DNA标准品稀释至2 mg/L，构建标准曲线。根据说明书中的浓度，将样品加入96孔板，每孔添加100 μL待测血清样本，加入100 μL染色反应液，在室温下避光孵育5 min。设置BioTek Synergy2酶标仪，温度37 ℃，激发波长480 nm，发射波长530 nm。绘制标准曲线，计算样品dsDNA浓度。
1.5 实时定量逆转录PCR法检测AIM2、caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18 mRNA表达
收集受试者外周静脉血5 mL，用肝素钠进行抗凝处理。按照RNA提取试剂盒的操作说明提取RNA，并使用Nano Drop 2000光谱分析仪检测RNA在260 nm和280 nm波长处的光密度(D)值，计算D260 nm和D280 nm比值。cDNA的合成按照逆转录试剂盒的说明书进行操作，条件为37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s；逆转录体系总量为20 μL(5×PrimeScript RT Master Mix 4 μL，根据测得的RNA浓度计算所需的RNA量，加入RNase Free dH2O至20 μL)。使用Nano Drop 2000光谱分析仪检测cDNA浓度，并将合成的cDNA冻存于-40 ℃冰箱备用。使用cDNA建立反应体系进行PCR扩增，总体积为20 μL(2×TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL、50×Rox Refe-rence Dye or Dye Ⅱ 0.4 μL、PCR正向引物0.8 μL、PCR反向引物0.8 μL、cDNA 2 μL、RNase Free dH2O 6 μL)。在以下反应条件下进行扩增：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 34 s，共进行40个循环。使用Biosystems 7500 PCR仪测定灰度值，并进行数据分析。最终实验结果以2-ΔΔCt的形式表示。
1.6 蛋白免疫印记法测定AIM2、caspase-1、GSDMD、IL-1β和IL-18蛋白水平
按照蛋白提取说明书的要求，向收集的新鲜血液标本中加入裂解液，在冰上裂解20 min后，以12 000 r/min的速度在4 ℃条件下离心10 min，取上清液即为所提取的蛋白。使用BCA法测定蛋白浓度，并根据最低蛋白浓度加入溴酚蓝进行调整。根据分子质量，选择10%或12%(质量分数)的雅酶一步法PAGE凝胶快速制备试剂盒进行蛋白电泳，按步骤进行转印、封闭和抗体孵育。使用发光成像仪获取条带图像，通过ImageJ软件进行条带分析。
1.7 ELISA法检测血清中IL-1β和IL-18表达水平
将收集的血清样本从-80 ℃的超低温冰箱中取出，平衡至室温；按照IL-1β和IL-18 ELISA试剂盒说明建立标准曲线，并加入待测血清和检测抗体；经过充分孵育和清洗后，进行显色反应。当标准孔出现明显的梯度变化时，停止反应，使用Rayto RT 6100酶标仪测定样本浓度。
1.8 统计学分析
使用SPSS 23.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料用均值±标准差表示，采用单因素ANOVA检验Bonferroni法进行组间比较；不符合正态分布的计量资料用中位数(范围)表示，采用非参数检验法进行组间比较；计数资料用例(百分数)表示。采用Pearson或Spearman相关进行相关性分析。检验水准设定为α=0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。使用GraphPad Prism 10.1.2软件生成图形，对图片进行处理时使用ImageJ软件。
2 结果
2.1 IIM患者中肌炎相关抗体和特异性抗体的分布情况
IIM组中包括：(1)10例DM患者(DM亚组)中4例抗黑色素瘤分化相关蛋白5(melanoma differentiation-associated protein 5，MDA5)抗体阳性，1例抗转录中介因子1γ(transcriptional intermediary factor 1γ，TIF1-γ)抗体阳性，5例抗体阴性；(2)5例PM患者(PM亚组)抗体均为阴性；(3)11例OM患者(OM亚组)中3例抗Jo-1抗体阳性，1例抗PL-12抗体阳性，1例抗PL-7抗体阳性，1例抗多发性肌炎-硬皮病(polymyositis-scleroderma，PM-Scl)抗体阳性，5例抗体阴性；(4)4例IMNM患者(IMNM亚组)均为抗信号识别颗粒(signal recognition particle，SRP)抗体阳性。IIM各个亚组间抗核抗体(antinuclear antibody，ANA)阳性率差异无统计学意义(P＞0.05)。
2.2 各组的临床资料与外周血特征
对健康对照组、IIM组及其各亚组患者的临床资料、实验室指标及疼痛程度、肌力、肌炎损伤程度、病情活动度等进行计算与评估，结果见表 2，可见各组间患者年龄差异无统计学意义，DM、PM、OM亚组和健康对照组女性患者占比均较男性高。除OM亚组外，IIM其他亚组MDI评分均提示肌肉轻度损伤；IIM各亚组肌炎VAS评分均呈中度活动状态，MDAAT量表和MYOACT评分均提示肌炎处于中低度活动状态，MMT评分均提示肌力轻度受损，但各亚组间差异均没有统计学意义(P＞0.05)。
表2 健康对照组和IIM组及其各亚组患者临床资料与实验室指标比较Table 2 Comparison of clinical data and laboratory indicators among the health control group, IIM group and its subgroups |
| Items | IIM group | |||||
| DM subgroup (n = 10) | PM subgroup (n = 5) | OM subgroup (n = 11) | IMNM subgroup (n = 4) | Total (n = 30) | HC group (n = 30) | |
| Demographic characteristics | ||||||
| Female | 9 (90.0) | 3 (60.0) | 8 (72.7) | 2 (50.0) | 22 (73.3) | 20 (66.7) |
| Age/years | 59.3 ± 11.7 | 52.6 ± 3.9 | 55.3 ± 15.5 | 65.5 ± 13.5 | 55.0 ± 15.1 | 53.1 ± 8.4 |
| Duration/months | 5.5 (3.5 – 12.3) | 24.0 (8.5 – 66.0) | 12.0 (1.0 – 180.0) | 14.0 (5.0 – 14.8) | ||
| Assessment of disease severity and activity | ||||||
| VAS score | 76.8 ± 9.4 | 75.7 ± 5.1 | 69.7 ± 21.5 | 68.3 ± 38.8 | ||
| MMT score | 65.1 ± 14.6 | 75.0 ± 3.0 | 66.0 ± 17.4 | 68.7 ± 16.3 | ||
| MYOACT score | 3.2 ± 0.9 | 2.6 ± 1.2 | 4.4 ± 1.2 | 3.9 ± 0.7 | ||
| MDAAT score | 7.0 (3.8 – 8.3) | 6.0 (4.3 – 8.5) | 6.0 (4.5 – 8.0) | 4.0 (3.3 – 6.3) | ||
| MDI score | 3.0 (2.0 – 7.5) | 5.0 (3.0 – 7.5) | 9.0 (4.0 – 19.0) | 2.5 (1.3 – 6.0) | ||
| Laboratory indicators | ||||||
| WBC/(×109/L) | 6.6 (6.0 – 7.4) | 7.0 (4.7 – 11.3) | 10.1 (5.5 – 12.4) | 10.1 (5.5 – 12.4) | 6.9 (6.1 – 8.7)* | 5.9 (5.0 – 6.5) |
| LY/(×109/L) | 1.1 (0.5 – 28.2)** | 0.8 (0.7 – 2.1) | 1.5 (0.7 – 1.8) | 1.6 (1.0 – 1.7) | 1.2 (0.5 – 28.2) | 1.4 (0.3 – 3.5) |
| Hb/(g/L) | 119.3 ± 17.1* | 136.2 ± 15.3 | 126.9 ± 18.4 | 130.3 ± 9.4 | 126.4 ± 16.9* | 140.0 ± 12.7 |
| ALT/(U/L) | 50.3 (9.0 – 290.4)** | 123.0 (47.0 – 340.0)* | 31.0 (11.0 – 340.0) | 81.0 (80.0 – 410.9)**▲ | 55.5 (9.0 – 410.9)* | 25.5 (10.0 – 89.0) |
| AST/(U/L) | 104.0 (12.0 – 441.7)** | 107.0 (27.0 – 266.0)* | 25.0 (10.0 – 136.0)△ | 106.0 (73.0 – 589.1)**▲ | 76.0 (10.0 – 441.7)* | 20.5 (13.0 – 55.0) |
| LDH/(U/L) | 513.5 (169.0 – 808.0)** | 543.0 (184.0 – 1335.0)** | 255.0 (162.0 – 1595.0)** | 1858.5 (891.0 – 1957.0)**▲▲ | 551.0 (162.0 – 1957.0)* | 174.0 (98.0 – 278.0) |
| CK/(U/L) | 442.0 (27.0 – 716.2)** | 2 554.0 (55.0 – 7690.0)** | 149.0 (36.0 – 1031.0)**△ | 3428.5 (131.0 – 1679.0)**▲▲ | 488.0 (27.0 – 1639.0)* | 90.0 (21.0 – 178.0) |
| CK-MB/(U/L) | 54.0 (13.1 – 573.5)** | 60.8 (9.8 – 432.3)** | 12.1 (9.0 – 54.1)**△ | 200.0 (181.4 – 899.2)**▲▲ | 31.35 (9.0 – 899.0)* | 12.0 (3.0 – 23.4) |
| TNT/(μg/L) | 27.0 (5.0 – 650.0)** | 200.0 (5.0 – 2820.0)** | 61.0 (5.0 – 279.0)** | 611.0 (383.0 – 2700.0)**▲▲ | 92.0 (5.0 – 650.0)* | 0.0 (0.0 – 10.0) |
| ESR/(mm/h) | 19.0 (2.0 – 58.0)** | 15.0 (2.0 – 35.0)** | 11.0 (2.0 – 106.0)** | 13.0 (10.0 – 46.0)** | 13.5 (2.0 – 106.0)* | 2.0 (2.0 – 12.0) |
| CRP/(mg/L) | 4.9 (2.9 – 59.3)** | 2.9 (1.3 – 11.0) | 4.4 (1.3 – 81.5)** | 9.1 (0.6 – 9.2) | 4.0 (0.6 – 81.5)* | 0.9 (0.2 – 2.5) |
| SF/(mg/L) | 187.5 (30.6 – 578.2)** | 255.5 (30.62 – 1632.0)** | 463.1 (142.0 – 1433.0)** | 626.3 (503.7 – 1345.0)**▲▲ | 364.8 (30.6 – 1632.0)* | 67.4 (15.8 – 176.5) |
| IgG/(g/L) | 16.9 ± 4.4* | 11.1 ± 4.6* | 11.6 ± 4.9* | 14.0 ± 0.6 | 13.6 ± 4.9* | 11.3 ± 3.6 |
| IgA/(g/L) | 3.3 (2.0 – 5.0)** | 1.8 (1.0 – 2.6)** | 2.2 (0.9 – 3.4) | 2.3 (1.9 – 3.2) | 2.3 (0.6 – 6.6) | 2.0 (0.8 – 4.1) |
| IgM/(g/L) | 1.3 (0.8 – 1.7) | 1.1 (0.3 – 2.3) | 1.0 (0.7 – 1.3) | 1.5 (1.2 – 1.8)**▲▲ | 1.1 (0.8 – 1.5) | 1.0 (0.8 – 1.4) |
| ANA positive | 6 (60) | 4 (80) | 9 (82) | 2 (50) | 21 (70) | 0 |
Data are expressed as median (range), $\bar x \pm s$ or n(%). * P＜0. 05, vs. health control; #P＜0. 05, vs. DM; △P＜0. 05, vs. PM; ▲P＜0. 05, vs. OM. IM, idiopathic inflammatory myopathy; DM, dermatomyositis; PM, polymyositis; OM, overlap syndrome; IMNM, immune-mediated necrotizing myopathy; HC, health conrol; VAS, visual analog scale; MMT, manual muscle testing; MYOACT, myositis disease activity assessment visual analogue scale; MAT, myositis disease activity assessment tol; MI, myositis damage index; WC, whit lood cell; LY, lyhyte; Hb, hoglobin; ALT, alanine aminotransferase; AST, aspartate aminotransferae; LDH, lactate dehydrogenase; CK, creatine kinase; CK-MB, creaine kinase isoenzyme; TNT, roponin T; ESR, erythrocyte sedimentation rate; CRP, C-reactive protein; SF, serum feritin; IgG, immunoglobulin G; IgA, immunoglobulin A; IgM, immunoglobulin M; ANA, antinuclear antibody. |
如表 2所示，与健康对照组相比，IIM组患者的血白细胞总数、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme，CK-MB)、肌钙蛋白T(troponin T，TNT)、ESR、血清铁蛋白(ferritin，SF)和免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)均明显升高，但血红蛋白(hemoglobin，Hb)明显降低(P均＜0.05)；IIM各亚组间比较提示，DM亚组的IgA和IgG水平明显高于PM组，OM亚组的CK-MB、SF和IgG水平明显高于DM亚组，IMNM亚组的LDH、SF水平明显高于DM亚组和PM亚组，PM亚组和IMNM亚组的AST、CK和CK-MB水平明显高于OM亚组(P均＜0.05)。
2.3 各组血清中dsDNA、IL-1β和IL-18水平
2.4 各组PBMC中mRNA相对表达
图2 健康对照组、IIM组及其各亚组(DM、PM、OM、IMNM)PBMC中mRNA的相对表达Figure 2 The relative expression of mRNA in PBMC of the health control group, IIM group and its subgroups (DM, PM, OM, IMNM) *P < 0.05, vs. HC; #P < 0.05, vs. PM; ▲P < 0.05, vs. DM. PBMC, peripheral blood mononuclear cell; Other abbreviations as in Table 1 and Table 2. |
2.5 各组PBMC中的蛋白表达
图 3显示，IIM及其各亚组的PBMC中，AIM2、caspase-1、GSDMD、IL-1β和IL-18蛋白的表达水平显著高于健康对照组(P＜0.05)；比较各亚组发现，OM亚组的IL-18蛋白表达显著高于PM亚组(P＜0.05), 其余亚组间两两比较差异均无统计学意义。
2.6 相关性分析
mRNA相关性分析表明，caspase-1、GSDMD、IL-18 mRNA均与AIM2 mRNA成正相关(r=0.465，P＜0.001；r=0.475，P＜0.001；r=0.325，P＜0.05)，但IL-1β mRNA与AIM2 mRNA不相关(r=0.087，P＞0.05，图 4)。蛋白相关性分析表明，caspase-1、GSDMD、IL-1β和IL-18蛋白均与AIM2蛋白表达水平呈正相关(r=0.788，P＜0.001；r=0.693，P＜0.001；r=0.805，P＜0.001；r=0.809，P＜0.001；图 4)。此外，血清ESR和SF水平也与AIM2蛋白表达水平呈正相关(r= 0.356，P＜0.01；r=0.585，P＜0.001；图 4)。
图4 IIM组和健康对照组PBMC中AIM2与mRNA、蛋白及血清炎性因子的相关性分析Figure 4 Correlation analysis of AIM2 with mRNA and protein in PBMC and serum inflammatory factors of IIM and health control groups PBMC, peripheral blood mononuclear cell; AIM2, absent in melanoma 2; GSDMD, gasdermin D; IL-1β, interleukin 1β; IL-18, interleukin 18. |
3 讨论
近年来，对于IIM发病机制的研究不断深入，学者们开始关注细胞焦亡在IIM中的作用[15-16]。本研究发现，与健康对照组相比，除了IMNM亚组的AIM2 mRNA、IL-1β mRNA及DM亚组的IL-1β mRNA差异无统计学意义外，IIM组及其他各亚组PBMC中AIM2、caspase-1、GSDMD、IL-1β和IL-18的mRNA和蛋白表达水平均显著升高。此外，AIM2 mRNA的表达水平与caspase-1、GSDMD和IL-18的mRNA的表达水平呈正相关，AIM2蛋白的表达水平与caspase-1、GSDMD、IL-1β和IL-18蛋白的表达水平呈正相关，提示AIM2/caspase-1/GSDMD炎性通路介导的细胞焦亡可能参与了IIM的发病过程。
AIM2炎症小体是细胞内唯一能够识别胞浆DNA的炎症小体，它由感受蛋白AIM2、衔接蛋白ASC和效应蛋白caspase-1原酶(pro-caspase-1)组成，能够特异性识别80~200 bp的dsDNA[19]。当胞质中存在可识别的dsDNA时，AIM2蛋白会聚集并与dsDNA结合，同时PYD结构域会募集并与ASC结合，ASC又与pro-caspase-1结合，最终形成AIM2炎症小体。AIM2炎症小体的激活会导致caspase-1的活化，进而促使炎性因子的释放，并剪切GSDMD，引发细胞焦亡[20]。本研究发现，在IIM及其亚组患者的PBMC中，AIM2的mRNA和蛋白水平均明显高于健康对照组，提示异常释放的dsDNA可能会激活AIM2的表达。此外，Loell等[9]的研究结果也表明，经过常规免疫抑制剂治疗后，PM和DM患者的AIM2和caspase-1蛋白水平均下调，这不仅说明AIM2参与了IIM的发病过程，还提示抑制AIM2可能成为未来治疗IIM的新靶点。
本研究发现，IIM组及其各亚组患者caspase-1 mRNA和蛋白表达水平均较健康对照组显著升高，这与Liu等[15]和Yin等[16]的研究结果一致，他们的研究也发现caspase-1的表达升高，但是是作为NLRP3炎症小体介导细胞焦亡的产物。AIM2炎症小体和NLRP3炎症小体都是NLR家族的成员，都参与细胞焦亡的经典激活途径。虽然它们之间的关系还需要进一步研究，但本研究发现AIM2蛋白的表达水平与caspase-1呈正相关。caspase-1作为细胞焦亡经典途径的主要效应蛋白酶，可以在多种刺激因子(如病毒、细菌和dsDNA等)的刺激下被炎症小体识别，从而被激活。激活的caspase-1能够切割IL-1β和IL-18的前体，形成具有活性的IL-1β和IL-18，进而促进炎症反应[21]。
IL-1β和IL-18是IL-1家族中常见的促炎因子，在机体的免疫应答中扮演着重要的角色。IL-1β主要由活化的巨噬细胞分泌，几乎影响所有类型的细胞，对细胞防御和组织修复至关重要，与疼痛、炎症和自身免疫有关。IL-18作为一种具有多种功能的细胞因子，既参与先天免疫又参与获得性免疫，其通过诱导其他细胞因子的产生(如IL-1β)，增强先天免疫应答。与IL-1β不同，正常细胞内有大量的IL-18，炎症刺激对IL-18前体产生几乎没有影响，IL-18的分泌主要与caspase-1有关。本研究发现，在IIM组及其各亚组患者的外周血清中，IL-1β和IL-18的表达水平与健康对照组相比均显著升高，且外周血PBMC中IL-1β和IL-18的mRNA和蛋白的表达水平均明显上调，与Yin等[16]、Aguilar-Vazquez等[22]和Papadopoulou等[23]的研究结果一致，他们通过不同的方法测得DM和PM患者血清中IL-1β和IL-18的表达也上调。此外，Tucci等[24]的研究发现IL-18在IIM患者的血清和肌肉组织中的表达均上调，并认为IL-18/IL-18R通路的失调是IIM的发病机制之一；另有研究发现IL-1β在IIM患者的血清中表达上调[15]，而IL-18在DM和PM患者的血清和肌肉组织中高表达[21, 24-26]。Svensson等[27]的研究发现，IL-1受体拮抗剂阿那白滞素治疗IIM患者取得了一定疗效，表明IL-1β参与了IIM的发病过程。上述研究结果均进一步证实了IL-1β和IL-18在IIM的发病中的重要性。
炎症小体活化的caspase-1不仅能够切割pro-IL-1β和pro-IL-18，还能激活效应蛋白GSDMD。GSDMD是Gasdermin蛋白家族的成员，是一种广泛表达于多种细胞和组织中的成孔蛋白质。GSDMD作为caspase-1的底物，是触发细胞焦亡的关键执行者[28]。GSDMD发生裂解后，其N端结构域通过与特定胞质结合，在细胞膜上形成直径为10~20 nm的孔道。细胞内物质外流，水逆渗透压内流，导致细胞肿胀、细胞膜破裂，细胞膜完整性丧失，进而引发细胞肿胀裂解，最终诱发细胞焦亡[5, 28]。本研究发现，与健康对照组相比，IIM组患者中GSDMD mRNA和蛋白表达水平均显著升高；相关性分析显示AIM2蛋白的表达水平与GSDMD蛋白的表达呈正相关，表明GSDMD可能参与了AIM2炎性小体介导的经典焦亡过程。Ma等[29]通过实验性IIM动物模型研究发现，实验组动物肌肉组织中GSDMD的蛋白表达水平高于对照组，且肌肉组织中GSDMD的mRNA水平及血清中IL-18、IL-1β水平均显著高于对照组。邓蕊等[30]对IIM患者的活检肌肉组织进行免疫组织化学染色，结果显示GSDMD在DM组和PM组患者肌肉组织中的表达均高于健康对照组，且Pearson相关分析提示DM组和PM组肌肉组织的苏木精-伊红染色病理学评分与GSDMD的免疫组织化学评分呈正相关。与本研究不同的是，这两项研究中GSDMD参与的细胞焦亡途径是由非经典途径蛋白质Caspase-4/5/11介导[29-30]。
综上所述，本研究结果提示AIM2介导的经典细胞焦亡通路可能参与IIM的发病过程，这一结论将有助于进一步探索IIM的发病机制，并为开发新的治疗药物提供理论依据。但由于本研究样本量较小，为单中心研究且存在选择偏倚等不足，未来还需要扩大样本量进行更深入的研究。
