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北京大学学报（医学版） >

2026 , Vol. 58 >Issue 1: 22 - 29

DOI: https://doi.org/10.19723/j.issn.1671-167X.2026.01.003

论著

细胞膜囊泡递送靶向肿瘤坏死因子-α的小干扰RNA对牙髓干细胞的抗炎作用

  • 高若凡 ,
  • 马天宇 ,
  • 王润楷 ,
  • 殷雨辰 ,
  • 李芮迪 ,
  • 王丹丹 , * ,
  • 夏斌 , *
展开
  • 北京大学口腔医学院·口腔医院儿童口腔科, 国家口腔医学中心, 国家口腔疾病临床医学研究中心, 口腔生物材料和数字诊疗装备国家工程研究中心, 北京 100081

收稿日期: 2025-09-19

  网络出版日期: 2025-11-27

基金资助

国家自然科学基金(82401182)

北京市自然科学基金-海淀原始创新联合基金(L232110)

版权

版权所有，未经授权，不得转载。
收起

Anti-inflammatory effects of cell membrane vesicle-mediated delivery of small interfering RNA targeting tumor necrosis factor-α on dental pulp stem cells

  • Ruofan GAO ,
  • Tianyu MA ,
  • Runkai WANG ,
  • Yuchen YIN ,
  • Ruidi LI ,
  • Dandan WANG , * ,
  • Bin XIA , *
Expand
  • Department of Pediatric Dentistry, Peking University School and Hospital of Stomatology & National Center of Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases & National Engineering Laboratory for Digital and Material Technology of Stomatology, Beijing 100081, China
WANG Dandan, e-mail,
XIA Bin, e-mail,

Received date: 2025-09-19

  Online published: 2025-11-27

Supported by

the National Natural Science Foundation of China(82401182)

the Natural Science Foundation of Beijing-Haidian Original Innovation Joint Fund(L232110)

Copyright

All rights reserved. Unauthorized reproduction is prohibited.
Fold

摘要

目的: 探索细胞膜囊泡(cell membrane vesicles, CMVs)作为广泛适用的基因沉默工具小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)递送平台的可行性, 并以脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的人牙髓干细胞(dental pulp stem cells, DPSCs)炎症模型验证其应用效果。方法: 采用细胞松弛素B处理3T3细胞制备CMVs, 并通过共聚焦显微镜、动态光散射检测CMVs理化性质。利用洋地黄皂苷透化CMVs将靶向肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)的siRNA(siTNF-α)负载至CMVs中, 构建CMVs@siTNF-α。通过流式细胞术和共聚焦显微镜检测siRNA负载与胞内转运效率。以LPS(1 mg/L)刺激DPSCs建立炎症模型, 并与CMVs或CMVs@siTNF-α共培养。采用细胞活力检测试剂盒(cell counting kit-8, CCK-8)检测细胞毒性, 实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)和酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测TNF-α、白介素(interleukin, IL)-1β和IL-6的表达与分泌。结果: CMVs呈球形, 由细胞膜及细胞质构成, 平均粒径为903 nm, 表面电位为-9.39 mV。流式细胞术结果显示, 负载荧光素酰胺(fluorescein amidite, FAM)标记siRNA(FAM-siRNA)后CMVs荧光强度升高; DPSCs加入CMVs@FAM-siTNF-α培养24 h后, 荧光信号增强。CCK-8检测结果显示CMVs及CMVs@siTNF-α对DPSCs无明显毒性。LPS处理显著上调DPSCs中TNF-α、IL-1β和IL-6的表达, 与LPS组相比, CMVs@siTNF-α下调TNF-α mRNA及其蛋白表达水平, 并抑制IL-1β和IL-6的转录与分泌。单独CMVs处理无明显差异。结论: CMVs可作为一种低毒性的siRNA递送平台, 在体外炎症模型中实现TNF-α沉默及下游炎症反应抑制, 具有进一步研究和应用的潜力。

关键词： 小干扰RNA; 细胞膜囊泡; 牙髓干细胞; 肿瘤坏死因子

本文引用格式

高若凡 , 马天宇 , 王润楷 , 殷雨辰 , 李芮迪 , 王丹丹 , 夏斌 . 细胞膜囊泡递送靶向肿瘤坏死因子-α的小干扰RNA对牙髓干细胞的抗炎作用[J]. 北京大学学报（医学版）, 2026 , 58(1) : 22 -29 . DOI: 10.19723/j.issn.1671-167X.2026.01.003

Abstract

Objective: To evaluate the feasibility of using cell membrane vesicles (CMVs) as a delivery system for small interfering RNA (siRNA) and to assess their performance in a lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammatory model of human dental pulp stem cells (DPSCs). Methods: CMVs were generated from cytochalasin B-treated 3T3 cells and characterized for their physicochemical properties, including morphology, size distribution, and zeta potential, using confocal microscopy and dynamic light scattering. To construct CMVs@siTNF-α, saponin-mediated transient permeabilization was used to facilitate siRNA loading, after which encapsulation efficiency was evaluated by flow cytometry and confocal imaging. Intracellular uptake behaviors were examined using flow cytometry in DPSCs. LPS (1 mg/L) was employed to establish a robust in vitro inflammatory microenvironment. DPSCs were subsequently treated with CMVs or CMVs@siTNF-α, and cell viability was assessed via CCK-8 (cell counting kit-8). The expression and secretion of tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β), and interleukin-6 (IL-6) were analyzed using quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) to evaluate both gene-silencing efficiency and downstream anti-inflammatory effects. Results: CMVs exhibited uniform spherical morphology with an average diameter of approximately 903 nm and a zeta potential of -9.39 mV, confirming successful vesicle formation. CMVs efficiently encapsulated FAM-labeled siRNA, as indicated by a pronounced fluorescence shift in flow cytometry and clear colocalization signals in confocal imaging. DPSCs cultured with CMVs@FAM-siTNF-α demonstrated increased intracellular fluorescence, reflecting efficient vesicle uptake and cytoplasmic siRNA release. Importantly, both CMVs and CMVs@siTNF-α displayed negligible cytotoxicity. LPS stimulation significantly elevated TNF-α, IL-1β, and IL-6 expression, validating the inflammatory model. CMVs alone did not affect cytokine levels, indicating biological inertness. In contrast, CMVs@siTNF-α significantly suppressed the LPS-induced upregulation of TNF-α at both mRNA and protein levels., demonstrating potent gene-silencing activity. Furthermore, suppression of TNF-α led to downstream attenuation of IL-1β and IL-6, with both transcription and secretion significantly decreased compared with the LPS group. These findings collectively confirmed that CMVs enabled efficient intracellular siRNA transport and effectively mitigate inflammatory responses in DPSCs. Conclusion: CMVs represent a biocompatible and effective siRNA delivery platform capable of achieving robust TNF-α knockdown and ameliorating inflammatory cytokine production in vitro, highlighting their potential for future nucleic acid-based anti-inflammatory therapies.

Key words： Small interfering RNA; Cell membrane vesicles; Dental pulp stem cells; Tumor necrosis factor

RNA干扰(RNA interference, RNAi)是一种真核细胞常见的基因调控机制，其中，小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)可通过与目标mRNA特异性结合并招募沉默复合物实现对靶mRNA的降解[1]。siRNA因其高度靶向性和设计灵活性，成为一种应用广泛的基因沉默工具，在炎症性疾病、肿瘤及遗传性疾病等领域显示出巨大的应用潜力[2]。然而，siRNA作为带负电的亲水性分子，难以跨越细胞膜进入细胞质，且易被核酸酶降解，导致其体内递送受限，这是其临床转化应用的关键瓶颈[3]。目前常用的siRNA递送方法主要是基于阳离子脂质体或脂质纳米颗粒(lipid nanoparticles, LNPs)的递送[4-5]。前者可在细胞水平实现较高转染效率，但常伴随明显的细胞毒性，限制了其体内应用；后者已在mRNA疫苗和首批siRNA药物中获得应用，显示出较好的体内递送能力，但在长期安全性和组织靶向性方面仍存在一定局限[6]。近年来，N-乙酰半乳糖胺(N-acetylgalactosamine, GalNAc)配体的引入虽推动了siRNA的临床转化，但其应用仍以肝靶向递送为主。如何实现对肝外组织的精准高效递送，仍是拓宽siRNA治疗应用范围的核心挑战[7-8]。
随着对药物递送系统研究的不断深入，基于天然细胞膜结构构建的生物及仿生载体逐渐成为近年来的研究热点，其中，细胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)作为天然来源的纳米载体，因其固有的良好生物相容性、低免疫原性以及跨膜转运能力，被认为是极具前景的递送载体。已有研究表明，天然EVs可通过转运核酸、蛋白质及脂质等分子介导细胞间通讯，在免疫调控、组织稳态维持及疾病进展中发挥重要作用[9-10]。然而，天然EVs的产量有限，纯化与规模化制备仍面临较大挑战，制约了其临床转化潜力。相比之下，人工诱导的细胞膜囊泡(cell membrane vesicles, CMVs)易于大规模制备，且可在一定程度上保留母细胞的膜结构与部分细胞质成分，为后续的功能化改造与靶向递送提供了可能[11]。此外，研究发现天然两亲性化合物皂苷能够选择性作用于膜胆固醇形成瞬时孔洞，可应用于小分子多肽、抗体及小核酸的负载[12-14]。CMVs兼具易于规模化制备与天然膜特性的优势，开发其在小核酸递送中的应用，可能为RNA干扰等治疗的临床转化提供新的思路。
人牙髓干细胞(dental pulp stem cells, DPSCs)来源于牙髓组织，既具有干细胞特性，又对炎症刺激敏感，常用于构建牙髓炎症的体外模型[15-16]。已有研究表明，脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)可诱导DPSCs表达肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白介素(interleukin，IL)-6、IL-8等炎症因子，因而DPSC-LPS模型可被用于验证抗炎策略的有效性[17-18]。TNF-α是经典的促炎因子，在炎症的启动和放大中起关键作用。沉默TNF-α表达可阻断炎症级联信号，从而减轻局部炎症反应[19-20]。基于此，本研究设计并构建了CMVs递送平台，装载并转运靶向TNF-α的siRNA(CMVs@siTNF-α)，并在LPS诱导的DPSC炎症模型中评估其作用，本研究旨在验证CMVs作为新型siRNA递送平台的可行性，为靶向TNF-α的抗炎治疗提供实验依据，以探索口腔疾病及其他炎症相关疾病治疗的新思路。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

α-最低必需培养基(alpha minimum essential medium, αMEM)、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、青霉素-链霉素溶液(100×)、0.25%(质量分数)胰蛋白酶溶液、磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline，PBS)购自武汉普诺赛生命科技有限公司，细胞松弛素B(cytochalasin B, CB)、LPS、毛地黄皂苷、4’, 6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(4’, 6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)、细胞活力检测试剂盒(cell counting kit-8, CCK-8)购自北京索莱宝科技有限公司，实验所需siRNA及荧光素酰胺(fluorescein amidite, FAM)标记的siRNA购自广州锐博生物技术有限公司，DiI红色细胞膜染料、5(6)-羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯[5-(and-6)-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester, cFDA-SE]、鬼笔环肽、Triton X-100购自上海碧云天生物技术有限公司，三氯甲烷、无水乙醇、异丙醇购自国药集团化学试剂有限公司，Evo M-MLV反转录试剂预混液购自湖南艾科瑞生物工程有限公司，SYBR Green qRT-PCR预混液购自上海翌圣生物科技股份有限公司，TRIzolTM试剂、人TNF-α、IL-1β、IL-6酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒购自美国Invitrogen公司。

1.2 DPSCs及3T3细胞的培养

DPSCs购自口腔干细胞库(北京泰盛生物科技有限公司)，并已完成干细胞标志物鉴定；3T3细胞系购自赛百慷(上海)生物技术股份有限公司；DPSCs和3T3细胞培养于含10%(体积分数) FBS、1%(体积分数)青霉素和链霉素的αMEM完全培养基中。所有细胞均培养于37 ℃，含5% (体积分数)CO2的恒温培养箱中。DPSCs的P3~P6代次用于后续实验。

1.3 细胞膜囊泡的制备及检测

当3T3细胞密度达到90%~100%时制备CMVs。弃去培养基后使用PBS缓冲液洗涤细胞，然后加入含有10 mg/L CB的αMEM培养基，在37℃条件下孵育30 min。再次用PBS洗涤3次以去除残余药物。加入适量胰蛋白酶溶液，37 ℃下消化直至完全脱落，并加入等体积完全培养基终止消化反应。所得细胞悬液转移至15 mL离心管中，经30 s涡旋以促进CMVs与细胞分离，随后以250×g离心6 min去除完整细胞。取上清转移至1.5 mL离心管，在6 500×g条件下继续离心30 min。弃去上清液，用PBS重悬沉淀后备用。
为观察细胞在CB诱导下的起泡过程，分别在普通光学显微镜和激光共聚焦显微镜下进行成像。对未处理和经CB处理30 min的3T3细胞在普通光学显微镜下进行形态学观察。用4%(质量分数)多聚甲醛固定细胞，在37 ℃条件下用10 mg/L DiI染色20 min，并在室温下用5 mg/L DAPI染色15 min。以0.1%(体积分数) Triton X-100处理5 min透膜，经PBS冲洗后在含1% (质量分数)牛血清白蛋白(bovine cerum albumin, BSA)的5 mg/L荧光标记的鬼笔环肽溶液中室温孵育90 min，使用共聚焦显微镜观察细胞。

1.4 siRNA的加载

使用洋地黄皂苷透化细胞膜囊泡加载siRNA。以无血清αMEM作为加载缓冲液，每100 μL加载体系中加入CMVs、siRNA及洋地黄皂苷。混匀后在37 ℃、300 r/min的条件下振荡金属浴20 min，加入适量CaCl2，继续在前述条件下振荡金属浴10 min，6 500×g离心30 min, 收集沉淀，使用PBS缓冲液重悬进行下一步实验。

1.5 流式细胞术测定

将CMVs@FAM-siTNF-α或经CMVs@FAM-siTNF-α处理24 h的DPSCs细胞收集重悬在PBS中，充分分散混匀，使用流式细胞仪对样本进行分析，根据前向散射光(forward scatter, FSC)和侧向散射光(side scatter, SSC)进行圈门排除其他成分。根据荧光信号强度判断是否携带siRNA分子。使用Flowjo软件对结果进行分析和绘图。

1.6 细胞毒性测定

将DPSCs以5×103个/孔的密度接种于96孔板中，加入100 μL完全培养基，培养24 h。弃去培养基，将细胞与CMVs或CMVs@siTNF-α共同孵育。24 h后弃去培养基，在避光条件下每孔加入100 μL含10 μL CCK-8的无血清培养基。继续孵育4 h，用酶标仪检测450 nm波长下的光密度值。

1.7 RNA提取和实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)测定

DPSCs经LPS及CMVs、CMVs@siTNF-α处理后加入适量TRIzol，使用氯仿和异丙醇抽提总RNA，加入Evo M-MLV反转录试剂预混液在37 ℃孵育15 min，85 ℃孵育15 s获得cDNA。随后在96孔板中每孔加入10 μL SYBR Green试剂、0.4 μL浓度为10 μmol/L的上下游引物，以及1 μL cDNA。在以下条件下进行qRT-PCR反应：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，循环40次。使用QuantStudio设计和分析系统进行数据分析。根据内参基因GAPDH的CT值计算基因的相对表达水平。本研究所用的引物序列如表 1所示。
表1 实时荧光定量PCR引物序列

Table 1 Quantitative real-time PCR primer sequence

Gene Forward primer (5′ to 3′) Reverse primer (5′ to 3′)
TNF-α AGCAAGGACAGCAGAGGA GGGGAGAGAGGGTGGAG
IL-1β TGTGCTGAATGTGGACTCA ACAAAAGGGCTGGGGAT
IL-6 TGTGTGAAAGCAGCAAAGA ACCAGGCAAGTCTCCTCA
GAPDH GCCAACGTGTCAGTGGTG AAGGTGGAGGAGTGGGTGT

PCR, polymerase chain reaction; TNF-α, tumor necrosis factor-alpha; IL-1β, interleukin-1 beta; IL-6, interleukin-6; GADPH, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.

1.8 酶联免疫吸附试验(enzyme-linkel immunosorbent assay, ELISA)测定

DPSCs经1 mg/L LPS及CMVs、CMVs@siTNF-α处理后采用ELISA试剂盒检测细胞培养上清中炎性细胞因子的含量。将100 μL培养基上清液加入反应孔中，于37 ℃孵育1 h。洗板，加入生物素化抗体工作液100 μL，于37 ℃孵育1 h。洗板，加入酶结合物工作液100 μL，37 ℃避光孵育30 min，随后每孔加入3, 3, 5, 5-四甲基联苯胺(3, 3，5-tetramethy/benzidint, TMB)底物100 μL，于避光条件下室温显色30 min。加入终止液100 μL终止反应，混匀后检测450 nm波长下的光密度值，根据标准曲线计算出各组细胞炎症反应相关因子TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌量。

1.9 统计学分析

使用GraphPad Prism 8.0.1软件，对数据进行Shapiro-Wilk正态性检验和Brown-Forsythe方差齐性检验，符合正态分布且方差齐的数据以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，并进行Tukey事后检验。所有检验均为双侧检验，P < 0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞膜囊泡的制备

CB可作用于细胞肌动蛋白骨架，诱导CMVs的产生[21]。在无血清培养基条件下以CB处理3T3细胞30 min后，于光学显微镜下可观察到细胞形态明显改变，表现为细胞体收缩并形成串珠状突起(图 1A)。为进一步验证细胞膜与骨架的变化，使用DiI和鬼笔环肽分别对细胞膜与肌动蛋白骨架进行荧光标记, 共聚焦显微镜观察发现，未经处理的3T3细胞骨架呈有序的纺锤状及网状结构；而经CB处理后，细胞明显收缩，部分骨架结构消失，残留骨架区域可见细长的管状膜性延伸物(图 1B)。进一步利用DiI对3T3细胞膜进行标记，并使用cFDA-SE对细胞质进行标记，对CB处理后的3T3细胞进行涡旋振荡及梯度离心获得CMVs，共聚焦显微镜结果表明，获得的CMVs呈球形，表面可见红色荧光标记的细胞膜，而内部含有绿色荧光标记的细胞质成分，提示所获CMVs主要由母细胞膜及细胞质构成(图 1C)。
图1 CMVs的制备及表征

Figure 1 Preparation and characterization of CMVs

A, morphological changes of 3T3 cells without treatment and after 30 min of cytochalasin B exposure under a light microscope (scale bar=100 μm); B, alterations of cell membrane and cytoskeleton in untreated and CB-treated (30 min) 3T3 cells observed by confocal microscopy (red: DiI, green: phalloidin, blue: DAPI; scale bar = 40 μm); C, confocal microscopy images of CMVs (red: DiI, green: cFDA-SE, scale bar = 20 μm) and magnified view (red: DiI, green: cFDA-SE, scale bar = 2 μm); D, size distribution of CMVs; E, zeta potential distribution of CMVs. DAPI, 4', 6-diamidino-2-phenylindole; cFDA-SE, 5-(and-6)-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester; DiI, 1, 1'-dioctadecyl-3, 3, 3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate; CMVs, cell membrane vesicles; CB, cytochalasin B.

采用动态光散射(dynamic light scattering, DLS)对CMVs的粒径分布进行检测，发现CMVs粒径呈单峰分布，平均直径为903 nm。进一步检测其表面电位，发现CMVs平均电位为－9.39 mV(图 1D和图 1E)。

2.2 siRNA加载

使用洋地黄皂苷处理的方法提高CMVs的膜通透性，并将FAM标记的siRNA加载至CMVs中，随后采用流式细胞术对负载效果进行检测，发现经siRNA负载后的CMVs荧光信号较对照组显著增强，提示siRNA已与CMVs结合(图 2A)。为了进一步验证这一结果，在共聚焦显微镜下观察CMVs@FAM-siTNF-α，成像结果显示可见红色CMVs影像和绿色siRNA影像共定位(图 2B)，进一步验证了CMVs对siRNA的包封。
图2 CMVs对siTNF-α的加载

Figure 2 Loading of siTNF-α into CMVs

A, flow cytometry analysis of CMVs with or without loading of FAM-siTNF-α; B, confocal microscopy images of CMVs@FAM-siTNF-α (red, DiI; green, FAM; scale bar=2 μm). DiI, 1, 1′-dioctadecyl-3, 3, 3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate; CMVs, cell membrane vesicles; FAM, fluorescein amidite; siTNF-α, small interfering RNA targeting tumor necrosis factor-alpha.

2.3 CMVs@siTNF-α在细胞内的表达和作用

首先检验CMVs具有被细胞吞噬并向DPSCs细胞转染siRNA的能力：将CMVs@FAM-siTNF-α与细胞共培养24 h后, 通过流式细胞术检验其对细胞的转染情况，发现细胞荧光信号增高，证明siRNA成功被转入细胞中(图 3A)。使用CCK-8法检测其在DPSCs中的细胞毒性：将DPSCs细胞与CMVs和CMVs@siTNF-α共同孵育24 h，发现CMVs及CMVs@siTNF-α对DPSCs无明显细胞毒性(图 3B)。
图3 CMVs@siTNF-α在DPSCs中的转运与抗炎效果

Figure 3 Intracellular delivery and anti-inflammatory effects of CMVs@siTNF-α

A, flow cytometry analysis of DPSCs with or without transfection of CMVs@siTNF-α; B, relative cell viability of DPSCs after treatment with CMVs or CMVs@siTNF-α, measured by CCK-8 assay; C, E, F, mRNA expression levels of TNF-α, IL-1β, and IL-6 in DPSCs under different treatments (blank, LPS, LPS+CMVs, or LPS+CMVs@siTNF-α), determined by qRT-PCR; D, G, H, protein secretion levels of TNF-α, IL-1β, and IL-6, assessed by ELISA. *P < 0.05; * *P < 0.01; * * *P0.001; ns, no significance. CMVs, cell membrane vesicles; siTNF-α, small interfering RNA targeting tumor necrosis factor-alpha; FAM, fluorescein amidite; LPS, lipopolysaccharide; TNF-α, tumor necrosis factor-alpha; IL-1β, interleukin-1 beta; IL-6, interleukin-6; DPSCs, dental pulp stem cells; qRT-PCR, quantitative real-time polymerase chain reaction; ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay.

使用LPS构建的DPSCs炎症模型验证CMVs@siTNF-α的有效性：qRT-PCR结果显示，DPSCs在经LPS处理后TNF-α显著上调，CMVs组差异无统计学意义，而CMVs@siTNF-α处理组相对于LPS组TNF-α mRNA表达量下调(图 3C)，证明CMVs@siTNF-α成功发挥了促转染效果且siRNA在胞内发挥了敲低作用。在蛋白层面进行进一步验证，ELISA结果显示，DPSCs在LPS处理后TNF-α分泌量显著上升，CMVs@siTNF-α处理组相对LPS组分泌量上升减少(图 3D)。
使用qRT-PCR检测CMVs@siTNF-α对相关炎症因子的表达的抑制作用，与对照组相比，LPS刺激后DPSCs中IL-1β(图 3E)和IL-6(图 3F)的表达量均显著上升；与LPS组相比，CMVs@siTNF-α显著降低DPSCs中IL-1β和IL-6表达水平。通过ELISA实验在蛋白层面上进一步验证CMVs@siTNF-α对炎症因子的抑制作用，发现与对照组相比，LPS刺激后DPSCs的IL-1β(图 3G)和IL-6(图 3H)的分泌量均显著上升；与LPS组和CMVs组相比，CMVs@siTNF-α组的IL-1β和IL-6的分泌量均显著降低。

3 讨论

siRNA是RNA干扰的核心工具，具有高度特异性和良好的设计灵活性，已成为基础研究中不可或缺的重要手段。同时，作为一种广谱性的基因沉默技术，在临床应用中展现出广阔前景。近年来部分siRNA药物已进入临床应用，如帕替西兰、英克司兰、吉伏西兰等，验证了siRNA在体内治疗中的可行性和有效性。目前临床应用的siRNA递送主要包括GalNAc配体递送和LNP递送。GalNAc配体对肝细胞表面高度表达的天冬氨酸糖蛋白受体具有较强的亲和力，从而使其偶联的siRNA药物在肝中有效富集，并实现对肝细胞内致病基因的特异性沉默[22]。这一策略也是当前市面上获批siRNA药物的主要递送机制，其适应证包括急性肝卟啉症及高胆固醇血症等。尽管LNP在mRNA疫苗中展现出显著优势，其长期安全性和组织靶向性仍有限，尤其在肝中存在非特异性沉积[23]。目前获批的LNP-siRNA药品仅有帕替西兰，应用于家族性甲状腺素蛋白淀粉样变性的治疗。总之，siRNA治疗具有广阔的临床应用前景，且已在实践中充分证明了它的安全性和有效性，但是肝外组织递送是限制其广泛使用的难题，因此探索新的、高效、低毒性、精准化的递送平台对于siRNA治疗策略的临床拓展至关重要。
随着对药物载体研究的不断深入，利用细胞衍生的膜结构制备生物型药物载体正引起越来越多的关注。CMVs作为天然来源的细胞产物，由母细胞的细胞膜和细胞质构成，表现出高度的生物相容性[24]。由于天然细胞膜具备选择通透性，不仅能够有效保护囊泡内的药物在血液循环中免受酶解或降解，还可降低免疫系统的识别和清除，从而提升药物在体内稳定性与安全性[11]。与天然EVs相比，CMVs的制备过程更为简便，产量可控，且在囊泡尺寸和表面结构上具有较好的均一性，能够满足实验室及潜在临床应用对可重复性和批量化生产的需求[21]。CMVs的平均直径与外泌体或LNPs相比较大，可通过巨胞饮作用或吞噬样机制进入细胞[11, 25-26]，更大的尺寸可带来更多表面膜蛋白及配体的展示、更强的多价结合效应和更强的生物大分子装载能力，从而提高了细胞结合与递送能力。在功能拓展方面，CMVs具有良好的可修饰性。已有研究表明，CMVs可通过基因工程或化学修饰赋予额外的功能。Wang等[11]发现可通过对母细胞的基因编辑使CMVs表面富集CXCR4，从而实现对CXCL12高表达炎症区域的靶向作用并大幅降低其在肝组织内的沉积。Peng等[24]利用核酸适配体的端基醛基与细胞膜表面的氨基残基反应，使其固定在细胞膜囊泡表面并发挥对肿瘤区域的靶向作用[24]。此外，其他研究也提出了通过在囊泡表面修饰抗体、配体或多肽h片段的方式来增强其对特定细胞或组织的识别能力，这些工作为CMVs在精准治疗中的应用开辟了新的方向[27-28]。以上特性使CMVs在核酸药物递送平台的探索中具有独特意义，有潜力成为具有广泛适应证的核酸药物递送平台。
本研究构建了基于CMVs的siRNA递送体系，并在LPS诱导的DPSCs体外炎症模型中验证了其可行性，研究表明，CMVs能够有效负载并递送siRNA，实现TNF-α的沉默，同时下调IL-1β和IL-6等下游炎性因子的表达。在维持较低细胞毒性的同时，CMVs并未引发非特异性的炎症通路激活或抑制，进一步证明其良好的安全性和生物相容性。上述结果表明，CMVs可作为一种可靠的siRNA递送平台，在炎症相关疾病治疗中显示出潜在的临床应用前景。对于口腔常见疾病，如牙髓炎和牙周炎，TNF-α在炎症发生与扩展中起关键作用[29-30]，CMVs@siTNF-α有望作为局部基因干预手段发挥作用。此外，TNF-α也与类风湿关节炎[31]、炎症性肠病[32]等系统性疾病密切相关，本研究提供的策略或许也可为其提供新的治疗思路。
尽管本研究初步验证了基于CMVs的siRNA递送体系的可行性，但其在实际应用中仍面临多项挑战。本研究主要基于体外实验，CMVs在体内的稳定性、组织分布、代谢途径以及长期安全性与有效性仍需系统性评估。鉴于临床实践中人源细胞获取困难和应用受限，本研究采用鼠源性细胞制备CMVs，在临床转化中仍需进一步优化CMVs的制备过程以降低免疫原性，后续可通过基因工程敲除特定膜抗原或利用渗透压调控减少细胞质残留，以获得更为纯净的“幽灵化”细胞膜囊泡[33]。在提升应用精准性方面，CMVs可通过表面修饰实现特定组织或病灶的靶向递送，并可结合缓释材料、局部注射或支架载体等策略，以增强治疗效果并降低潜在副作用。进一步提升siRNA的负载效率、实大规模制备、质量控制和精确定量仍是应用过程中的核心瓶颈，需建立标准化的制备与检测体系。
综上所述，本研究初步验证了CMVs作为siRNA递送平台的可行性，结果显示其在LPS诱导的体外炎症模型中能够实现高效的基因沉默并产生抗炎作用，同时具备良好的生物安全性，且具备可拓展的功能修饰潜力。本课题组未来将进一步开展体内验证，探索其靶向性提升策略、标准化的生产与纯化流程以及可行的临床应用模式，以期为siRNA的临床转化提供新的思路与路径。

参考文献

原文顺序 | 文献年度倒序 | 文中引用次数倒序
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