目的:克隆胸腺细胞发育相关新基因.方法:应用抑制性差减杂交技术(suppression subtractive hybridization, SSH),构建了胸腺基质细胞系cDNA差减杂交文库,结合RACE及RT-PCR进一步克隆并验证新基因的cDNA全长序列.结果:筛选两个不同胸腺基质细胞系的差异表达基因,获得了差异表达的cDNA片段,克隆后挑选阳性克隆进行测序,成功克隆8个新基因片段.对其中两个新基因克隆C55和C91进行Northern杂交分析,mRNA转录体长度分别为1.4 kb及1.5 kb,C55的表达在两种胸腺基质细胞系中存在显著差异.进一步克隆了C55和C91两个新基因的cDNA全长序列,已被GenBank所接受.结论:抑制性差减杂交技术是克隆新基因片段的有效方法;成功克隆8个新基因片段及两个新基因的cDNA全长序列.

目的:了解凋亡相关新基因TFAR19编码蛋白分子中潜在的Ser100磷酸化位点与其促凋亡效应的关系.方法:利用重叠延伸PCR定点突变技术构建TFAR19 Ser100→Ala100突变体,用DNA测序技术验证,大肠杆菌表达,离子交换技术纯化重组突变蛋白,将其加入培养的白血病细胞株HL-60,通过PI染色,流式细胞仪分析,观察突变重组蛋白的促凋亡效应.结果:构建成TFAR19 Ala100突变体,并经DNA测序所证实,在大肠杆菌中获得了高水平表达,Western blot表明突变型重组蛋白与野生型具有相同的免疫学活性,流式细胞仪分析发现突变蛋白对撤除血清的HL-60细胞具有与野生蛋白相似的剂量依赖性促凋亡效应. 结论:TFAR19 分子中潜在的Ser100磷酸化位点对其促凋亡效应无影响,提示TFAR19发挥其生物学活性时无需cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶活化.

目的:探讨非造血系统来源的恶性肿瘤细胞内Ig样蛋白与Ig分子在抗原性及分子结构上的关系.方法:应用亲和层析的方法将HeLa MR(人宫颈癌传代细胞)细胞内Ig样蛋白进行了纯化;并以SDS-PAGE及Western Blot方法将Ig样蛋白与IgG进行比较分析.结果:SDS-PAGE结果显示Ig样蛋白既有与IgG相近的轻、重链泳带,同时又分别在相对分子质量6 600、7 000左右出现两条泳带,此两条泳带与人IgG具有高度一致的抗原性.Western Blot结果显示,Ig样蛋白与IgG相同,不但可与抗人IgG多克隆抗体、单克隆抗体反应而且可与Protein A蛋白发生反应.结论:Ig样蛋白与IgG比较在抗原性上具有明显的一致性,而在分子结构上也表现明显相似性,但二者不完全相同.

目的:探讨神经递质降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP) 与银屑病皮损Langerhans细胞的相关性,研究银屑病的发病机制.方法:抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物法确定CGRP的靶细胞,用双相间接免疫荧光染色法,把CD1a单克隆抗体和CGRP抗体作用于寻常型银屑病斑块型皮损同一切片,用PE-αM IgG和FITC-αR IgG 抗体显示,通过激光扫描共焦显微镜观察,并利用RNA探针原位杂交技术,研究表皮树枝状细胞CGRP的来源.结果:免疫组化染色银屑病皮损显示CGRP阳性表皮树枝状细胞,经双相免疫荧光染色及激光扫描断层光切,可见CGRP存在于银屑病皮损表皮CD1a+ Langerhans细胞膜表面,Langerhans细胞内有CGRPmRNA的表达.结论:寻常型银屑病斑块型皮损表皮Langerhans细胞与神经肽CGRP密切接触,同时Langerhans细胞内有CGRPmRNA的表达.

目的:建立药物诱导狼疮(drug-induced lupus, DIL)的动物模型,研究狼疮诱导药物对小鼠免疫功能的影响.方法:用普鲁卡因酰胺(procainamide, Pca)、盐酸肼苯哒嗪(hydralazine, Hyd)和2,2′-偶氮-双(3-乙苯基-噻唑啉-6-硫酸)诱导DIL的动物模型.用3H-TdR参人法分析细胞增殖,流式细胞分析法分析细胞表型.结果:Pca和Hyd能诱导BALB/C小鼠而不是C57BL/6小鼠产生抗核抗体.对用药BALB/C小鼠的免疫功能(包括对外来抗原的免疫应答、外周血中淋巴细胞的分型等)的分析发现其部分免疫功能的异常.结论:狼疮诱导药物能够导致BALB/C小鼠部分免疫功能的紊乱.

目的:研究Yaa基因与骨髓B细胞系细胞的分化发育是否有相互关系.方法:用Whitlock-Witte法从骨髓细胞中培养纯化出B细胞系细胞,继而检测B细胞系细胞对脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激后的表型、增殖反应和抗DNA抗体的产生以及对地塞米松诱导后的凋亡情况.结果:用Whitlock-Witte法成功地从骨髓细胞中培养分离出B细胞系细胞.经LPS刺激后,雌雄BXSB小鼠B细胞系细胞膜表面CD19抗原和膜表面Ig的分布相似,都出现较强的增殖反应和产生IgM类型的抗ssDNA和dsDNA 抗体,但是对地塞米松诱导的凋亡作用不敏感.结论:Yaa基因对BXSB小鼠骨髓中B细胞系细胞的分化发育无影响,提示Yaa基因仅在外周免疫器官的成熟B细胞中表达活性;并且BXSB小鼠骨髓中的自身反应性B细胞系细胞未被删除,可能是产生自身抗体的内在原因之一.

目的:研究年龄对小鼠腹腔注射IL-1β的影响.方法:用放射免疫法测定不同年龄的小鼠腹腔注射IL-1β后血浆中的皮质酮水平.结果:年老小鼠安静时血浆皮质酮的水平高于年轻小鼠;老年组动物在平时高皮质酮的水平上,注射IL-1β还能使皮质酮水平更高.全身麻醉可以完全阻断注射IL-1β引起血浆中皮质酮水平的升高.结论:老龄小鼠安静时血浆皮质酮水平升高,注射IL-1β后血浆皮质酮水平还可进一步升高.IL-1β引起血浆中皮质酮水平升高可能是在中枢神经系统调控下完成的.

目的:分析EB病毒膜抗原(membrane antigen, MA)BLLF1基因在转基因小鼠外周血淋巴细胞中的表达.方法:EB病毒膜抗原BLLF1基因转基因首建鼠4只,尾组织经PCR检测携带有BLLF1基因,用流式细胞仪分析MA在外周血淋巴细胞中的表达并用激光共焦显微镜确定MA在细胞中的表达部位.结果:4只首建鼠中有2只KM-Tg-EBV1和KM-Tg-EBV5外周血淋巴细胞中有MA的表达,表达部位在细胞浆中和细胞膜上.结论:表达EB病毒膜抗原的转基因小鼠可作为研究EB病毒致病机制的一个新的动物模型.

目的:比较rhTRX与rhTRXδ3对细胞因子依赖株TF-1细胞、NFS60细胞撤除细胞因子所诱导凋亡的抑制及促细胞增殖作用.方法:在大肠杆菌中克隆并表达重组hTRX和hTRXδ3,纯化rhTRX与rhTRXδ3蛋白,FACS检测凋亡细胞,MTT法检测细胞增殖.结果:在依赖IL-3、GM-CSF生长的TF-1细胞(人红白血病细胞)和依赖G-CSF生长的NFS60细胞(小鼠白血病细胞)撤除细胞因子后,加入rhTRXδ3比加入rhTRX能更有效地抑制这两种细胞的凋亡并有促增殖的作用.结论:重组hTRX和hTRXδ3有着不同的生物活性,rhTRXδ3有着更强的抑制这两种细胞的凋亡和促增殖的作用.

目的:研究应激免疫抑制蛋白(immunosuppressive protein of stress, ISPS)的细胞来源.方法:免疫荧光染色后,运用流式细胞仪和激光扫描共焦显微镜两种技术对ISPS进行定性和定量研究.结果:流式细胞仪结果发现无论在正常还是应激条件下,ISPS均在T淋巴细胞上表达,且应激后ISPS表达量在T淋巴细胞显著升高至正常时的3倍.在激光扫描共焦显微镜下,直接观察到分离纯化的T淋巴细胞中有ISPS阳性细胞存在,且发现T细胞的两类亚群均具有产生ISPS的功能.结论:T淋巴细胞可以产生ISPS.

目的:观察去甲肾上腺素在体外诱导正常大鼠淋巴细胞产生应激免疫抑制蛋白.方法:采用体外培养的方法,以ConA活化正常大鼠的淋巴结细胞,同时加入去甲肾上腺素共同孵育12～16 h,测定细胞提取物对正常小鼠淋巴细胞转化的影响.并利用应激免疫抑制蛋白单克隆抗体以抗体中和及ELISA法,鉴定应激免疫抑制蛋白.结果:去甲肾上腺素(10-5～10-3 mol.L-1)可在体外诱导以ConA活化的淋巴细胞产生一种能抑制正常淋巴细胞转化的物质.用应激免疫抑制蛋白单克隆抗体所作的抗体中和及ELISA测定发现,提取物中的抑制物可被应激免疫抑制蛋白单克隆抗体识别.结论:去甲肾上腺素可以在体外诱导ConA活化的淋巴细胞产生应激免疫抑制蛋白.

目的:建立高效简便的人重组粒细胞集落刺激因子突变体rhG-CSF-Ala-17纯化工艺,并对其进行鉴定.方法:大肠杆菌表达的rhG-CSF-Ala-17经包涵体洗涤、变性复性后,采用DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和Superdex75凝胶过滤层析分离纯化.经SDS-PAGE和FPLC检测纯度,并进行N端氨基酸序列分析、比活性分析、紫外最大吸收光谱分析、内毒素检测等指标对其进行鉴定.结果:纯化后的rhG-CSF-Ala-17纯度可达99.64%,比活为1×108 U*mg-1.其N端19个氨基酸分析与预期序列一致,紫外最大吸收光谱位于280 nm,氨基酸的组成与预期结果一致,内毒素含量低于部颁标准.结论:两步层析即可获得高纯度的rhG-CSF-Ala-17重组蛋白质,为进一步的rhG-CSF-Ala-17临床前和临床研究打下了基础.

目的:探索抗Ia单克隆抗体促进"细胞+环磷酰胺(cyclophosphamide,CP)"系统诱导移植耐受的作用及其机制.方法:BALB/C(H-2d)小鼠经尾静脉注入C57BL/6(H-2b,B6)小鼠脾细胞,48 h后腹腔注射CP,接着两天分别经尾静脉注入抗小鼠Ia单克隆抗体500 μg,然后进行皮肤移植,并于耐受30 d对受体小鼠作混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction,MLR)、迟发型超敏反应(delayed type hypersensitivity,DTH)等耐受状态的检查.结果:B6小鼠的皮肤移植物在耐受BALB/C小鼠中存活期特异性延长,MLR和DTH检查证明BALB/C小鼠对B6小鼠的脾细胞产生特异性耐受,对无关第3者KM小鼠的脾细胞仍表现出强烈的免疫反应.机制研究发现,克隆不应答(anergy)和抑制细胞在耐受中起作用.结论:抗Ia单克隆抗体可明显促进"细胞+CP"诱导的异基因皮肤移植耐受.克隆不应答和抑制细胞是耐受的主要机制.

目的:研究雷公藤多甙(tripterygium wilfordii hook f multi-glycosides,TWG)对角朊细胞株(COLO-16)的增殖抑制及对凋亡的影响,并探讨其治疗免疫性皮肤病的机制.方法:MTT法检测细胞增殖抑制,二苯胺及PI染色法检测细胞凋亡,RT-PCR测细胞bcl-2及bcl-Xs mRNA表达.结果:TWG 0.25 mg.L-1与角朊细胞共育72 h后,角朊细胞增殖活性受抑,此抑制作用具药物(质量)浓度依赖性;TWG 1 mg.L-1作用于角朊细胞72 h,即可使片段化DNA含量及亚二倍体细胞百分数较对照明显增加,此现象随药物质量浓度增加而增高;TWG 5 mg.L-1,可上调角朊细胞bcl-Xs mRNA表达,此作用随药物作用时间延长而增强;TWG对bcl-2 mRNA表达则无明显影响.结论:TWG可抑制角朊细胞株增殖并诱导其凋亡,此诱导凋亡机制可能与bcl-Xs上调有关.

目的:构建抗卵巢癌单链抗体183B2ScFv 与假单孢外毒素(peudononas exotoxin, PE38)的融合蛋白表达载体并制备抗人卵巢癌单链免疫毒素蛋白183B2ScFvPE38,为卵巢癌导向治疗打下基础.方法:采用基因工程技术,经过3次亚克隆,将编码单链抗体的基因及编码毒素的基因亚克隆至原核表达载体pET30a(+)上,并在IPTG的诱导下进行表达.采用直接ELISA及细胞杀伤对抗体及毒素部分的活性进行检查.结果:表达蛋白183B2ScFvPE38具有较好的抗体活性及毒素活性.结论:抗卵巢癌单链免疫毒素183B2ScFvPE38 具有良好的免疫学活性及生物学活性,可能有良好的应用前景.

目的:获得高纯度的人心肌肌钙重组蛋白,为临床上检测心肌损伤及预后提供新的诊断方法.方法:利用RT-PCR方法从人心肌细胞的cDNA文库中扩增编码人心肌肌钙蛋白Ⅰ的cDNA,并克隆到大肠杆菌表达载体中,表达含凝血酶识别序列的MS2-cTnI 融合蛋白,纯化后用Western-blot进行鉴定.结果:从人心肌cDNA文库中扩增出编码人cTnI的cDNA,克隆并在大肠杆菌中表达,表达量达30%以上.经离子交换柱纯化,最终产物纯度在95%以上.可与其特异性单克隆抗体反应.结论:cTnI能够在大肠杆菌中高效表达和纯化,为今后检测心血管疾病提供了一种高效快捷的方法.

目的:探讨IL-6和B7双基因转染的小鼠肿瘤疫苗是否具有协同的抗肿瘤效应.方法:利用含小鼠B7分子和人IL-6分子cDNA的逆转录病毒载体pLmB7SN和pLhIL-6SN分别转染包装细胞株CRIP,经G418抗性筛选后以含有B7或IL-6外源基因的病毒颗粒感染小鼠EL-4胸腺瘤细胞,观察EL-4-IL-6、EL-4-B7、EL-4-IL-6+B7细胞在同基因宿主体内的致瘤性及作为抗肿瘤疫苗的能力.结果:相对亲本肿瘤细胞EL-4而言,单基因和双基因转染的EL-4细胞在小鼠体内的生长速度均明显减慢,小鼠存活时间均有一定延长,3种转基因的EL-4细胞经X-射线灭活后免疫小鼠,虽均未能阻止随后接种的EL-4细胞的生长,但小鼠存活时间都明显延长,IL-6和B7双基因转染的EL-4肿瘤细胞在抗肿瘤活性方面与IL-6或B7单基因转染的EL-4细胞差异无显著性.结论:与单基因表达疫苗比较,双基因表达疫苗没有表现出协同的抗肿瘤效应.

目的:观察IL-4对诱导骨髓干细胞分化形成破骨细胞的作用.方法:用终浓度为10-8 mol.L-1的1,25(OH)2D3诱导成年小鼠骨髓干细胞分化形成破骨细胞,在此过程中加入不同质量浓度梯度的 IL-4(0、0.1、1、10 μg.L-1) 以及用IL-4的抗体中和IL-4.取IL-4(1 μg.L-1)处理过的第6天的培养上清液,先用抗IL-4抗体中和残余IL-4,再以体积分数1%,10%,20%,0加入另一新培养4 d含有骨片的骨髓细胞培养体系中,计数骨片上骨吸收陷窝数及面积,玻片上抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP)阳性多核细胞和单核细胞数.结果:随IL-4(质量)浓度的增加,骨片上形成的骨吸收陷窝及面积数,玻片上的TRAP阳性细胞数呈量的依赖性的减少,加抗体组抵消了IL-4的抑制作用,加条件培养液组和未加组上述参数没有显著差别.结论:IL-4具有抑制骨髓干细胞分化形成破骨细胞的作用,这种作用不是通过使其它细胞形成可溶性因子,可能是直接作用于靶细胞(能分化为破骨细胞和巨噬细胞的前体细胞),使定向分化为TRAP阳性单核细胞的前体细胞转向分化为巨噬细胞, 破骨细胞数目减少,从而抑制了骨吸收.

银屑病发病机制的神经免疫调节是在一定的遗传背景基础上,神经系统通过分布于皮肤的神经末梢释放神经肽作用于皮肤的免疫细胞(包括Langerhans细胞、T淋巴细胞、单核巨噬细胞和内皮细胞等),影响这些细胞的生物学功能.其中T淋巴细胞是银屑病发病过程中的主要效应细胞,由于T淋巴细胞调节的紊乱,导致T细胞表型和功能的变化,释放相关的细胞因子,可能诱导了银屑病表皮角朊干细胞增殖状态的病理性改变,使角朊细胞过度增殖、表皮可凋亡的角朊细胞异常分化,从而诱发银屑病发病机制的神经免疫调节紊乱的病变过程.目前研究表明,在与皮肤有关的神经递质中,降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP)是与皮肤免疫细胞联系较密切的神经肽,能刺激人皮肤微血管内皮细胞分泌趋化因子,影响免疫细胞的迁移.同时,在银屑病斑块型皮损内,CGRP的分泌释放增加,并与皮损表皮的Langerhans细胞密切接触,对银屑病斑块型皮损持续存在和发展的病变过程可能具有一定的意义.

目的:研究低密度脂蛋白受体相关蛋白6(low density lipoprotein receptor related protein6, LRP6)的胞内代谢及其与淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)的相关性.方法:构建含有APP羧基端106个氨基酸的融合表达质粒,用酵母双杂交系统筛选人胎脑cDNA文库.结果:发现LRP6的羧基端可以和含有β淀粉样蛋白和胞内区的APP片段相互作用.结论:使与AD相关的两个重要蛋白载脂蛋白E和APP联系起来,并提示LRP6可能在APP的代谢和β淀粉样蛋白的产生中起重要作用.

目的:总结急性完全性颈脊髓损伤继发低钠血症的发生率及变化规律,并推测其发生机制.方法: 回顾总结分析了本院1992～1998年住院的35例急性Frankel-A型颈脊髓损伤患者的血尿生化变化及其时间变化规律.结果:35例急性颈脊髓损伤患者伤后平均(2.8±1.8) d入院,平均住院时间(52±13) d.低钠血症发生率100%,低钠血症于伤后(4.5±1.2) d开始,(14±3) d达高峰,15例(42.88%)出院时低钠血症仍未恢复.此外,还可出现高碳酸血症、氮质血症、多尿以及尿钠排出量明显增多等变化,而血钾的变化始终在正常范围内波动. 结论: 严重、顽固的低钠血症是颈脊髓损伤后极为常见的并发症,其发生机制可能与脑耗盐综合征有关.

目的:研究HIV-1感染者缺损HIV-1 DNA的特性.方法:用长片段PCR法(LD-PCR)研究分析HIV-1感染者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear, PBMCs)和体外培养感染淋巴细胞中HIV-1基因特征,使用位于HIV-1 DNA链两端的LTR(U5)、LTR(R)为引物,插入有全长HIV-1基因片段的大肠杆菌质粒PNL4-3等为标准对照,并对部分标本克隆测序.结果:经扩增9.1 kb是LD-PCR的主要产物,但在10例HIV-1感染者中有9例PBMCs检测出大小不一、范围较广的缺失HIV-1基因片段,经用基因探针杂交,发现近HIV-1基因中心部位缺失频率增加,缺失结合点常存在3～4个核苷酸短片段直接重复,体外培养中HIV-1基因缺损量减少,完整和缺失基因的存在与培养中病毒分离的时间密切相关.结论:HIV-1感染者PBMCs中存在大量HIV-1基因重组和缺损片段.

目的:探讨前列腺增生间质结节的演化过程,进一步认识前列腺增生病理组织学分类依据.方法:应用免疫组织化学方法对55个前列腺增生的间质结节做了波形蛋白、肌细胞肌动蛋白、平滑肌肌动蛋白和第Ⅷ因子相关抗原的免疫组化染色.结果:结合HE切片和免疫组化结果发现前列腺间质结节的早期为幼稚的纤维性结节,随着结节内肌纤维母细胞向平滑肌细胞和纤维细胞的双向分化,间质结节可继续演化为纤维肌性结节和肌性结节.55个结节按免疫组化分类,纤维性结节占42%,纤维肌性结节占51%,肌性结节占7%.结论:前列腺早期的纤维性结节随着肌纤维母细胞向平滑肌和纤维细胞的分化而演化为纤维肌性结节和肌性结节,明确这种演化过程可进而认识前列腺增生的病理学分类.