北京大学学报(医学版) ›› 2018, Vol. 50 ›› Issue (1): 13-19. doi: 10.3969/j.issn.1671-167X.2018.01.003
刘凯宁,孟焕新△,侯建霞
LIU Kai-ning, MENG Huan-xin△, HOU Jian-xia
摘要: 目的:维生素D受体(vitamin D receptor,VDR)基因的第二外显子存在唯一一个可以影响VDR蛋白结构的多态性位点,其可以由限制性核酸内切酶FokⅠ所识别,分为FF、Ff和ff三型。CYP24A1是维生素D 24羟化酶的编码基因,是常见的维生素D效应基因。本研究将探讨人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblasts,hGF)和牙周膜细胞(human periodontal ligament cells,hPDLC)中VDRFokⅠ多态性对CYP24A1表达的影响。方法:原代培养12名供体的hGF和hPDLC,提取基因组DNA,PCR扩增包含多态性位点的267 bp的片段。根据FokⅠ对片段酶切的结果判断VDR-FokⅠ基因型。确定基因型后,给各基因型hGF和hPDLC以10 nmol/L 1α,25双羟维生素D3(1,25OH2D3)或1 000 nmol/L 25羟维生素D3(25OHD3)刺激48 h,提取RNA,其中10 nmol/L 1,25OH2D3刺激48 h后还提取蛋白。之后给予hGF和hPDLC VDR拮抗剂ZK159222,再以10 nmol/L 1,25OH2D3或1 000 nmol/L 25OHD3刺激48 h,提取RNA。应用Real-time PCR和Western blot的方法检测维生素D24羟化酶CYP24A1和VDR的mRNA和蛋白的表达水平。结果:12名供体中,FF、ff和Ff型分别为4例、3例和5例。1,25OH2D3刺激hGF和hPDLC后,FF型细胞CYP24A1的mRNA表达水平显著高于Ff型或ff型细胞(hGF:F=31.147,P<0.01;hPDLC:F=23.347,P<0.01);FF型细胞CYP24A1的蛋白表达水平同样显著高于Ff型或ff型细胞(hGF:F=12.368,P<0.01;hPDLC:F=15.749,P<0.01)。25OHD3刺激hGF和hPDLC后,FF型细胞CYP24A1的mRNA表达水平也显著高于Ff型或ff型细胞(hGF:F=32.061,P<0.01;hPDLC:F=32.569,P<0.01)。如1,25OH2D3刺激伴有ZK159222,则三型细胞CYP24A1的mRNA表达水平差异无统计学意义(hGF:F=0.246,P=0.787;hPDLC:F=0.574,P=0.583)。如25OHD3刺激伴有ZK159222,则三型细胞CYP24A1的mRNA表达水平差异也无统计学意义(hGF:F=1.636,P=0.248;hPDLC:F=0.582,P=0.578)。不同刺激条件下,hGF和hPDLC两种细胞比较CYP24A1或VDR的表达水平,差异均无统计学意义。结论:在hGF和hPDLC中,FF型VDR可介导比其他基因型VDR更为显著的CYP24A1上调,提示FF型VDR可能具有更强的转录活性。
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