北京大学学报(医学版) ›› 2012, Vol. 44 ›› Issue (5): 725-731.

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一种新的荧光示踪的钠离子-葡萄糖协同转运蛋白2活性测定方法的建立

张晓琳,杨晓萌,李娟,付健阳,田金英,叶菲△   

  1. (新药作用机制研究与药效评价北京市重点实验室,中国医学科学院药物研究所药理室,北京100050)
  • 出版日期:2012-10-18 发布日期:2012-10-18

  • Online:2012-10-18 Published:2012-10-18

摘要: 目的:建立一种新的荧光标记的钠离子-葡萄糖协同转运蛋白2(sodium-glucose cotransporter 2,SGLT2)葡萄糖转运的测定方法。方法:合成人全长SGLT2 cDNA,构建pIRES2-EGFP-SGLT2重组质粒,酶切鉴定并测序验证其构建的正确性。瞬时转染HEK293细胞后,构建SGLT2高表达细胞株;采用激光共聚焦扫描显微镜、流式细胞仪检测其转染效率及转录活性,Western Blot 法检测目的蛋白SGLT2表达情况。以荧光标记的脱氧葡萄糖2-NBDG作为示踪剂,应用流式细胞术检测SGLT2对葡萄糖的转运活性。 结果:构建的pIRES2-EGFP-SGLT2质粒经酶切鉴定、测序证明质粒构建正确。该质粒转染HEK293细胞后,与未转染组相比,转染组细胞绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)表达明显增加(P<0.01)。与空载体pIRES2-EGFP转染组相比,重组质粒转染组SGLT2蛋白表达明显增加(P<0.05);而未转染组与空载体转染组SGLT2蛋白表达无明显差异。SGLT2转运试验结果显示,转染组细胞对2-NBDG的钠离子依赖性摄取率较未转染组明显升高(P<0.01)。结论:成功构建并应用SGLT2真核表达质粒,建立了一种新的荧光示踪的SGLT2葡萄糖转运活性的测定方法。

关键词: 钠-葡萄糖转运体2, 脱氧葡萄糖, 荧光, 流式细胞术

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