通过引物设计和提高退火温度提高实时定量PCR检测microRNA的特异性

北京大学学报（医学版） ›› 2009, Vol. 41 ›› Issue (6): 691-698.

通过引物设计和提高退火温度提高实时定量PCR检测microRNA的特异性

何湘君△, 张旗 , 刘玉京，潘秀英

（北京大学人民医院临床分子生物学研究所，中心实验室，北京100044）

收稿日期:2009-04-27 修回日期:2009-09-30 出版日期:2009-12-18 发布日期:2009-12-18

Received:2009-04-27 Revised:2009-09-30 Online:2009-12-18 Published:2009-12-18

摘要/Abstract

摘要：

目的：了解因某些microRNA (miRNA) 家族成员序列相似，以及同一种成熟miRNA的长度不均一对PCR定量检测结果的影响，寻找区分相似miRNA成员和准确定量的方法和条件。方法: 采用RNA加尾和引物延伸实时定量RT-PCR法，设计不同位置错配的引物，以克隆到质粒中的全长成熟miRNA为模板，比较在不同退火温度下各种错配引物与完全匹配引物在扩增miRNA上的效率差异，并根据由此得出的经验设计let-7家族成员引物，以克隆的成熟miRNA为模板，检测其在不同退火温度下区分相似家族成员的能力。此外，设计了10组3′末端碱基位置不同的特异引物，比较了它们在检测小鼠大脑miRNA表达水平上的差异。结果：提高退火温度12 ℃~14 ℃将最大限度增加特异性而不降低敏感性，将引物的3′ 末端置于差异碱基或其附近可以有效区分相似miRNA序列，将引物3′ 末端置于miRNA第18~20个碱基，可避免漏检较短的成熟miRNA，使定量更真实准确。结论：精心设计引物并提高退火温度可提高实时定量PCR检测microRNA的特异性和准确性。

关键词: 微RNAs, 逆转录聚合酶链反应, DNA引物, 基因表达谱

何湘君, 张旗, 刘玉京, 潘秀英. 通过引物设计和提高退火温度提高实时定量PCR检测microRNA的特异性[J]. 北京大学学报（医学版）, 2009, 41(6): 691-698.

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