目的:建立一个在短时间内获取大量活化胱天蛋白酶-3的方法.方法:将胱天蛋白酶-3酶原的基因从真核表达载体中克隆到原核表达载体pMTY4-His中,在大肠杆菌中以包涵体的形式表达MS2-胱天蛋白酶原-3融合蛋白;将包涵体变性,经酸化和浓缩进行体外活化;对所得蛋白用Western blot和活性试验进行鉴定.结果:构建成pMTY4-His-胱天蛋白酶-3原核表达载体,在大肠杆菌中获得了较高水平表达的胱天蛋白酶原-3酶原-MS2融合蛋白.体外活化后每升诱导菌可获得约10 mg蛋白,用抗胱天蛋白酶-3单克隆抗体证实所得蛋白为胱天蛋白酶原-3,活性试验证实得到高活性的蛋白.结论: 成功地建立了大量获取高活性的胱天蛋白酶-3的方法,为深入研究胱天蛋白酶-3的功能和性质提供物质基础.

目的:观察2/100 Hz电针(electroacupuncture, EA)对吗啡戒断大鼠中枢相关区域神经元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase, nNOS)表达的影响.方法:给大鼠腹腔注射(i.p.)递增量吗啡10 d,造成大鼠对吗啡的依赖.在最后一次注射吗啡后12和24 h分别给予2/100 Hz EA 30 min.电针结束后30 min,取大鼠脊髓和脑,采用免疫组织化学方法和计算机图象分析技术,对脊髓腰膨大(L4-L5)、蓝斑(locus coeruleus, LC)、中脑导水管周围灰质(periaqueductal gray, PAG) nNOS的原位表达进行观察及半定量分析.结果:吗啡戒断大鼠脊髓L4-L5第X板层、LC及PAG腹外侧区的nNOS阳性神经元数量显著增多,L4-L5第I-IV板层、LC及PAG的nNOS的免疫染色光密度(D)明显增强; 给予2/100 Hz EA后,吗啡戒断大鼠上述部位的nNOS阳性神经元的数量明显减少,nNOS的D值显著降低.结论:2/100 Hz EA能抑制吗啡戒断大鼠中枢相关区域nNOS的表达,提示这是EA治疗吗啡戒断症状的机制之一.

目的:观察N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体拮抗剂氯胺酮(ketamine)在不影响运动功能的条件下,是否能抑制吗啡依赖大鼠的戒断症状.方法:给大鼠连续注射递增剂量吗啡5 d,造成其对吗啡的依赖,用纳洛酮催促戒断症状的出现.应用行为药理学的研究方法,经腹腔(2～16 mg*kg-1)、侧脑室(4～100 μg)及相关核团(0.4～10 μg)给予不同剂量的氯胺酮.结果:反复4次(1)腹腔注射8 mg*kg-1,最后一次注射3 h后,能显著抑制2种戒断症状;16 mg*kg-1能显著抑制3种戒断症状.(2)反复4次脑室注射100 μg 氯胺酮,能显著抑制2种戒断症状.(3)伏核内注入0.4～10 μg的氯胺酮可显著抑制4种戒断症状,但注入杏仁核则无效.结论:在不影响大鼠运动功能的条件下,氯胺酮对吗啡戒断症状有明显抑制作用,伏核可能是其中枢作用部位.

目的:研究同型半胱氨酸诱导基因(homocysteine induced gene,HCY-2)在大鼠体内的表达及分布,为进一步探讨该新基因的功能奠定形态学基础.方法:用免疫组织化学ABC法染色,对成年Wistar大鼠心、肝、脾、肺、肾、大脑、小脑及脊髓等器官中HCY-2基因的表达与分布状况进行形态学观察与半定量分析. 结果:发现心脏中HCY-2阳性反应物质主要在心肌纤维、Pukinje纤维、大动脉中膜平滑肌和外膜营养血管平滑肌中;肾中HCY-2表达强烈,分布较广泛;脊髓前脚运动神经元和中央管室管膜细胞、肺内小支气管至肺泡管上皮及肺泡Ⅱ型细胞HCY-2均高表达;肝、大脑、小脑中表达很弱;胰腺和脾几乎没有表达.结论:同型半胱氨酸诱导基因在大鼠体内分布广泛,但在不同器官中的表达强弱不甚相同,同一器官内HCY-2分布也有极大差异.

目的:探讨甲亢性心肌病的发病机制.方法:建立甲亢性心肌病模型,观察心肌肥厚指数、心肌细胞直径、心肌胶原容积分数、心肌羟脯氨酸含量、超微结构改变、肌浆网钙泵(myocardial sarco/endoplasmic Ca2+-ATPase,SERCA)活力及心肌血管紧张素Ⅱ1型受体(angiotensin Ⅱreceptor type 1,AT1)mRNA表达的变化,以氯沙坦和福辛普利阻断肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system,RAS)的不同部位,观察RAS在甲亢性心肌病模型中的作用.结果:L-甲状腺激素腹腔给药二周可致左右心室肌明显肥厚,胶原组织增生,肌浆网钙泵活力下降,AT1受体上调,氯沙坦和福辛普利可防止甲状腺素诱导的心肌肥厚形成.结论:RAS和SERCA在甲亢性心肌病的发生中起重要作用.

目的:在中国汉族人群中寻找儿茶酚-O-甲基转移酶(catecholamine-O-methyl transferase, COMT)基因Val158Met多态性与精神分裂症发病特点之间的关系. 方法:使用病例-对照研究方法,对符合诊断标准的476名精神分裂症患者/207名正常对照就COMT基因Val158Met多态性进行检测并进行关联分析.结果: (1)非慢性患者的Val158Val基因型Val158等位基因分布频率显著高于对照组,对年龄、性别等调整后结果仍然成立; (2) 早发病组(25岁前起病)患者杂合子(Val158Met)及等位基因Met158分布频率显著高于晚发病组(P<0.05).结论:COMT基因可能与精神分裂症或某些临床特点存在关联.

目的:探讨母亲对氧磷酶2基因[二乙基对硝基苯磷酸酯酶2基因(PON2148)]多态性位点和细胞色素P450IIE1基因(CYP2E1)多态性位点对低出生体重的影响.方法: 采用病例对照研究方法,使用统一设计的调查问卷,由经过培训的调查员于1998至1999年在安徽省安庆市各县级医院对入院分娩孕妇及其单胎、活产的低出生体重儿和正常出生体重的对照新生儿进行调查,共得到有效样本231个母亲新生儿对,其中低出生体重组65对, 正常出生体重对照组166对.结果:单因素分析结果显示,突变纯合子基因型/杂合子基因型与野生纯合子基因型比较,未见CYP2E1多态性位点和PON2 148多态性位点导致低出生体重的危险性有显著性增加.多因素Logistic回归模型经母亲年龄、文化程度、生育史,新生儿性别、孕周混杂因素调整后,可见CYP2E1多态性位点和PON2 148多态性位点均导致低出生体重的危险性增加(CYP2E1,OR=2.4, 95%CI为1.17～4.89; PON2148,OR=2.16, 95%CI为1.06～4.41), 并且有显著的统计学意义.经进一步分析CYP2E1多态性位点和PON2148多态性位点之间对低出生体重的影响,其结果显示:这两个多态性位点之间无明显交互作用,它们是低出生体重的独立危险因素.结论:CYP2E1多态性位点和PON2 148多态性位点与新生儿低出生体重相关,但CYP2E1多态性位点和PON2148多态性位点之间对低出生体重的影响无明显交互作用.

目的:研究体外循环停机后管道内机血的不同处理方式对术后炎性反应的影响.方法:2001年7月23日～11月22日在我院行择期体外循环下冠脉搭桥手术的24例患者随机分为试验组(血液回收组)和对照组(机血直接回输组).试验组将停机后管道内机血用自体2000型血液回收机洗涤浓缩处理后回输,对照组直接回输.所有患者均在麻醉后、停机后1、6、24、48 h测定sC5b-9、IL-6、TNFα水平.分别测定回收机处理前后sC5b-9、IL-6、TNFα水平.所有数据均以当时测得Hct校正.结果:机血经回收机处理后sC5b-9、IL-6、TNFα水平显著降低.试验组中sC5b-9在停机6、24、48 h均显著低于对照组.IL-6停机48 h在试验组显著低于对照组.TNFα水平以及变化率在术后两组间差异无显著性.试验组在停机48 h中性粒细胞计数显著低于对照组.结论:停机后机血经回收机处理后可以去除机血中绝大部分炎性介质,经处理后回输可以降低术后部分炎性介质的水平,减轻体外循环术后的炎性反应.

目的: 探讨内皮素受体拮抗剂Bosentan对大鼠硝酸甘油耐药的改善作用.方法: Wistar 大鼠28只,随机分成对照组(C组,n=10),硝酸甘油组(NTG组,n=6), Bosentan组(n=6),硝酸甘油+Bosentan组(NTG+Bosentan组,n=6).观察各组大鼠对硝普钠(SNP)的降压反应.用放射免疫方法测定各组血浆和血管组织的内皮素-1(ET-1) 含量.结果: NTG组大鼠对SNP的降压反应最弱,NTG +Bosentan组大鼠对SNP的降压反应明显强于NTG 组大鼠, NTG +Bosentan组大鼠离体主动脉环对不同浓度SNP的舒张反应较NTG组大鼠有明显的改善. NTG +Bosentan组大鼠血浆及血管组织ET-1含量与NTG组大鼠比较差异无显著性,均明显高于C组大鼠.结论:内皮素受体拮抗剂Bosentan可以改善NTG耐药的发生.

目的:构建和表达一种可与卵巢癌细胞和淋巴细胞结合的双特异抗体.方法:利用PCR分别扩增抗人CD3单链抗体(single chain variable fragment, ScFv)重链可变区(variable region of the heavy chain, VH)和轻链可变区(variable region of the light chain, VL),重组抗人CD3 ScFv,经测序后将其克隆入有链间连接肽基因序列的载体pALM中,再将抗人卵巢癌COC183B2 ScFv克隆至紧邻链间连接肽前形成COC183B2/抗CD3单链双特异抗体(single-chain bispecific antibody, scBsAb)的重组.最后将COC183B2/抗CD3 scBsAb克隆入表达载体pTMFC中进行表达,同时分别表达抗人卵巢癌单抗COC183B2和抗人CD3单抗的ScFv作为对照组.用ELISA、流式细胞学方法和玫瑰花环实验对scBsAb进行免疫学活性测定.结果:成功构建抗人卵巢癌COC183B2/抗CD3 scBsAb;其表达的蛋白链相对分子质量约60;ELISA结果显示scBsAb可与抗原OC183B2结合,流式细胞学结果显示scBsAb可与抗原CD3结合,花环实验显示scBsAb在体外可引导效应细胞聚集在靶细胞周围.结论:构建和表达抗人卵巢癌COC183B2/抗CD3 scBsAb成功,且具有与抗原OC183B2、CD3结合的免疫学活性.

目的:研究伊文思蓝脂质体在小鼠体内的组织分布状况,为研究脑靶向脂质体奠定基础.方法:用反相蒸发法制备伊文思蓝脂质体,用凝胶柱分离的方法测得脂质体的包封率为25.07%,比较了伊文思蓝脂质体和伊文思蓝水溶液在小鼠体内的组织分布状况.结果:磷脂与胆固醇的比例对伊文思蓝脂质体的包封率有较大的影响;尾静脉注射后2～4 h时脂质体组在脑中伊文思蓝的浓度高于水溶液组.结论:伊文思蓝可作为检测脂质体跨血脑屏障的模型药物,脂质体对药物跨血脑屏障有一定的促进作用.

目的:比较盐酸丁卡因脂质体凝胶与盐酸丁卡因游离药物凝胶的离体皮肤渗透性,探讨脂质体作为盐酸丁卡因的载体对皮肤渗透的影响.方法:采用体外双室渗透池作为离体皮肤的渗透试验装置,测定盐酸丁卡因在接受液内的累计透过百分率和在皮肤内的滞留百分率.结果:盐酸丁卡因脂质体凝胶和游离药物凝胶相比,药物透过皮肤的速度明显减慢,累计透过百分率与时间之间均符合Hihuchi方程;以卡波普为基质的盐酸丁卡因脂质体凝胶涂于皮肤24 h后,在皮肤内滞留量为36.7%,而游离药物凝胶皮肤内滞留量为9. 7%.结论:脂质体有促进药物进入皮肤的能力,而药物进入接受液中的量并不增加.

目的:研究幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)的代谢产物在胃黏膜上皮细胞增殖中的作用.方法:用液体培养的方法培养产毒Hp菌株NCTC11637,然后提取上清液,用浓缩上清液(concentrated broth culture supernatant,CCS)灌鼠胃.采用放射免疫方法测定血请胃泌素,用免疫组织化学SP(streptavidin/perosidase)法检测胃黏膜增殖细胞核抗原 (proliferation cell nuclear antigen,PCNA)和表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的表达.结果:灌服CCS组与对照组比较,胃黏膜PCNA标记指数阳性率升高、差异具有显著性,胃黏膜细胞表皮生长因子受体在灌服CCS组有4/8阳性,对照组无1例阳性;血清胃泌素升高,但统计学上差异无显著性.结论:产毒Hp培养上清液可以促进胃黏膜上皮细胞的增殖,可能促进胃癌的发生.

目的:检测单剂量哌甲酯对注意缺陷多动障碍(attention deficit hyperactivity disorder,ADHD)儿童脑α波竞争图的影响,探讨其预测ADHD患儿疗效的可行性.方法:应用脑电超慢涨落分析技术(encephaloflutuograph technology, ET),对符合DSM-Ⅳ中ADHD诊断的38例患儿在服用哌甲酯前及服药后2h的脑电信号进行分析处理.结果:(1)用药后ET各指标变化:主频明显提高(P=0.000); O1、F7、F8、T5、T6 导联8 Hz优势几率明显下降(P<0.05); 总熵值呈降低趋势,其中 QC3、QP4、QO1、QO2、QT5、QT6明显降低(P<0.05).(2)用药后反应组ET特点: 用药后反应组主频明显低于用药后无反应组(P<0.05),总熵值及各脑区熵值均明显高于用药后无反应组(P<0.05).结论:服用单剂量哌甲酯后ET主频、熵值的改变,有望成为预测ADHD儿童对哌甲酯反应性的客观依据;主频左移、高熵值组对于单剂量哌甲酯较为敏感.

目的:观察白细胞介素-18(interlenkin,IL-18)在博莱霉素致大鼠肺纤维化模型中的表达,探讨其在肺纤维化发病机制中的作用.方法:雄性Wistar大鼠分为3组:博莱霉素模型组30只,气管内一次性注入博莱霉素A5 5 mg*kg-1,分别于第1、3、7、14、28天各处死6只;阿奇霉素治疗组12只,气管内注入博莱霉素后2 h开始于胃管内给阿奇霉素(80 mg*kg-1*d-1,每周3次)治疗,分别于第7、28天各处死6只;对照组6只,气管内及胃管内均给生理盐水,第7天处死.对HE染色病理结果进行计算机灰度扫描半定量分析,用RNA酶保护实验的方法检测IL-18 mRNA的表达,用免疫组织化学方法检测肺组织IL-18蛋白的表达.结果:IL-18在正常肺组织有一定水平的表达,自气管内注入博莱霉素第1天开始迅速升高,至第7天达高峰后逐渐下降,第28天时仍高于正常.经阿奇霉素有效抗炎治疗后,其表达明显下降.免疫组织化学显示活化的肺泡巨噬细胞和间质单核细胞是IL-18的主要来源,某些细支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞和纤维化严重区域的成纤维细胞也有表达.结论:IL-18是肺纤维化中重要的前炎症因子,不仅参与早期的肺损伤和炎症的维持、发展,也可能参与纤维化的形成.阿奇霉素可抑制IL-18在肺纤维化大鼠肺组织中的表达.

目的:了解Shh(Sonic hedgehog),Bmp-4,Ptc(patched)基因在角化囊肿中的表达情况,明确Shh及其相关基因在角化囊肿发病中的作用.方法:选取角化囊肿石蜡切片.将Shh,Bmp-4,Ptc分别转染与大肠杆菌XL-1-Blue,提质粒,线性化质粒,体外转录法合成地高辛标记的RNA探针,原位杂交检测角化囊肿中Shh,Bmp-4,Ptc的表达情况.结果:Shh,Bmp-4共同表达于角化囊肿上皮细胞,胞浆呈强阳性表达;Ptc表达于角化囊肿间充质细胞,胞浆表达较弱.结论:Shh,Bmp-4,Ptc在角化囊肿中都有异常表达,提示(1)角化囊肿的发生与生长发育中的上皮残余有关;(2)Shh与Ptc之间平衡的破坏是发生角化囊肿的条件之一;(3) 角化囊肿与正常生长发育相似,存在Bmp-4与Shh协同表达.