幽门螺杆菌硫氧还蛋白-1基因克隆及其重组蛋白表达与活性测定

摘要/Abstract

摘要： 目的：克隆幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, Hp）硫氧还蛋白-1（thioredoxin-1, Trx1）基因，构建含有该目的基因的原核细胞表达载体，表达纯化该蛋白，并检测该蛋白活性。方法：以Hp国际标准菌株26695的总RNA为模板，设计含有酶切位点的特异性引物，用逆转录PCR的方法扩增Hp Trx1的cDNA，连接至pEASY-T1载体构建成pEASY-T1-Hp Trx1。对pEASY-T1-Hp Trx1进行双酶切后将目的片段连接至pET-30a，形成pET-30a-Hp Trx1重组质粒，并在大肠杆菌BL21 plys S中进行表达。应用镍柱亲和层析纯化重组的Hp Trx1蛋白，并检测其二硫键还原酶的活性。结果：测序结果显示Hp Trx1 cDNA成功连入pET-30a质粒，且与GenBank（HP0824）完全一致。含质粒pET-30a-Hp Trx1的大肠杆菌BL21 plys S成功表达出Hp Trx1蛋白，活性检测显示重组Hp Trx1蛋白具有二硫键还原酶的活性。结论：成功构建原核表达载体pET-30a-Hp Trx1，并表达、纯化出有活性的Hp Trx1蛋白，为进一步研究Hp Trx1的生物学活性及其对肿瘤发生的作用机制奠定了基础。

关键词: 幽门螺杆菌, 硫氧还蛋白质类, 重组蛋白质类, 遗传载体

Abstract: Objective：To clone the Helicobacter pylori (Hp) thioredoxin-1 (Trx1) gene and construct the recombinant expression vector containing the target gene, then to express and purify the protein, and detect its activity. Methods：The cDNA gene of the Hp Trx1 was amplified by RT-PCR from the international standard strain 26695, using the specific primers containing double endonuclease digesting sites. The Hp Trx1 cDNA was then inserted into the pEASY-T1 vector to construct the pEASY-T1-Hp Trx1 recombinant vector. The next step was to double digest the pEASY-T1-Hp Trx1 recombinant vector and insert the target gene into pET-30a to construct the pET-30a-Hp Trx1 recombinant vector, which was transferred to E.coli BL21 plys S to express the Hp Trx1 protein. The recombinant protein was purified by Ni affinity chromatography, and then its activity of disulfide reductase was detected. Results：By DNA sequencing, the Hp Trx1 cDNA was successfully inserted into the pET-30a vector and was in accordance with GenBank(HP0824). The E.coli containing pET-30a-Hp Trx1 recombinant vector successfully expressed Hp Trx1 protein. Through the detection of the activity, the recombinant Hp Trx1 protein was identified to have the activity of disulfide reductase. Conclusion：The prokaryotic expression vector pET-30a-Hp Trx1 was successfully constructed. The recombinant protein Hp Trx1 was successfully expressed and purified, which had the activity of disulfide reductase. This study lays the foundation for further research on the biological activity of Hp Trx1 and the mechanism of its function in tumor genesis.

Key words: Helicobacter pylori, Thioredoxins, Recombinant proteins, Genetic vectors

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