西罗莫司对肌成纤维细胞表达Ⅰ型胶原和纤维连接蛋白的抑制作用

摘要/Abstract

摘要： 目的:在细胞水平探讨西罗莫司[sirolimus,又名雷帕霉素(rapamycin)]的抗肾纤维化作用.方法:采用原代培养的大鼠肾皮质肌成纤维细胞(myofibmblast,MyoF).实验各时间点分别设对照组和用西罗莫司40 mg/L处理组.将细胞培养12 h,24 h,48 h后分别收集细胞和细胞培养上清液,用Western blot方法检测细胞内α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、纤维连接蛋白(fibronectin,FN)、Ⅰ型胶原(type Ⅰ collagen,Col-Ⅰ)和上清液中FN,Col-Ⅰ蛋白水平的表达;用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)法检测细胞培养1 h,2 h,4h,6 h各时间点前胶原Ⅰ(procollagen-Ⅰ)mRNA表达的变化;用明胶酶谱法检测细胞培养上清液中基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)的活性.实验结果分别以各时间点对照组作为基线1,计算与对照组的比值.结果:(1)西罗莫司于各个时间点对细胞内α-SMA的表达均无影响.(2)用西罗莫司处理后,于24 h对细胞内Col-Ⅰ蛋白表达量明显少于对照组,并持续至48 h,分别为各时间点对照组的(0.58±0.05)倍和(0.63±0.18)倍,差异有统计学意义(P<0.05).(3)与各时间点对照组相比,细胞内procollagen-Ⅰ mRNA在1 h,2 h时表达均减少,分别为(0.38±0.05)倍和(0.55±0.16)倍,差异有统计学意义(P<0.05),于4 h恢复到基础水平.(4)培养细胞上清液中12 h即有Col-Ⅰ基础表达,经西罗莫司处理24 h其表达量较对照组明显减少,为对照组的(0.59±0.25)倍,差异有统计学意义(P<0.05),持续至48 h仍呈减少趋势.为对照组的(0.52±0.21)倍,P<0.05.(5)细胞内FN蛋白表达趋势与上清液中一致,24 h其表达量较对照组明显减少,分别为对照组的(0.44±0.09)倍和(0.40±0.15)倍,差异均具有统计学意义(P<0.05),48h西罗莫司对FN的抑制作用消失.(6)经西罗莫司处理12 h,24 h和48 h,上清液中MMP-2和MMP-9的活性均无明显变化.结论:西罗莫司可以通过抑制MyoF的Col-Ⅰ和或FN的表达而发挥其抗肾纤维化的作用.

关键词: 西罗莫司, 成纤维细胞, 纤连蛋白类, 胶原Ⅰ型

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